تنقية البروتين    هي عملية إدخال تسلسلات الأحماض النووية المشفرة للبروتينات إلى الخلايا المضيفة من خلال تقنيات الهندسة الوراثية، مما يؤدي إلى التعبير عنها بكميات كبيرة، ثم تنقيتها في المختبر باستخدام طرق التنقية المناسبة من أجل الحصول على بروتينات عالية النقاء والنشاط والإنتاجية . يمكن تصنيف أنظمة التعبير البروتيني إلى أنظمة بدائية النواة وأنظمة حقيقية النواة.

لمبادئ وطرق تحفيز التعبير البروتيني في الأنظمة بدائية النواة وتنقية البروتينات في المختبر باستخدام تحليل كروماتوجرافي متقارب . يرد أدناه وصف

1、التنظيم السلبي لمناول اللاكتوز:

في غياب اللاكتوز، يكون مناور lac في حالة ردع، وفي ذلك الوقت يعبر تسلسل I عن بروتين رادع Lac للارتباط بتسلسل O، مما يمنع بوليميراز RNA من الارتباط بتسلسل P ويمنع بدء النسخ. عند وجود اللاكتوز، يدخل اللاكتوز إلى الخلية ويتم تحفيزه بواسطة β-galactosidase ويتحول إلى إيسولاكتوز، الذي يرتبط بالبروتين المثبط، مما يسبب تغيرًا توافقيًا في البروتين ويؤدي إلى تفكك البروتين المثبط من تسلسل O، وبالتالي بدء النسخ.

يعمل إيزوبروبيل ثيوجالاكتوزيد (IPTG) بنفس الطريقة التي يعمل بها إيزوجالاكتوز وهو محفز قوي للغاية ولا يتم استقلابه بواسطة البكتيريا وهو مستقر جدًا، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع في المختبرات.

2- اختيار السلالة المضيفة:

(1) BL21 هي واحدة من السلالات الأكثر استخدامًا للتعبير بدائيات النواة، وهي مناسبة بشكل أساسي للتعبير عن البروتينات غير السامة باستخدام بوليميراز E. coli، لذلك يمكن تطبيقها على التعبير عن أنظمة بدائيات النواة باستخدام بوليميريز E. coli RNA مثل tac أو trc (على سبيل المثال pGEX، pMAL plasmids).

(2) يدمج BL21(DE3) جين بوليميريز T7 RNA في منطقة lect phage DE3 على كروموسوم سلالة BL21، والذي يمكنه التعبير عن كل من بوليميريز T7 RNA وبوليميريز E. coli RNA ، ويمكن استخدامه للتعبير عن البلازميدات مثل سلسلة pET، وpGEX، وpMAL، وما إلى ذلك.

3، طرق تنقية البروتين:

(1) كروماتوجرافيا ترشيح الهلام: وفقًا للحجم الجزيئي من الخليط لفصل البروتينات، وشكل البروتينات المختلفة والحجم الجزيئي للاختلافات في الخليط من خلال عمود كروماتوجرافيا ترشيح الهلام الذي يحتوي على جزيئات الحشو، نظرًا لاختلاف الحجم الجزيئي للبروتينات المختلفة، فإن الانتشار في الحجم المحدد لجزيئات الفتحة ذات القدرة على الاختلاف، وكلما كانت جزيئات البروتين أكبر، كلما كانت جزيئات البروتين أول من يتم إخراجها من الجزيئات أصغر كلما تأخر الشطف.

(2) كروماتوغرافيا التبادل الأيوني: يعتمد فصل البروتين وتنقيته على الشحنات المختلفة على سطح البروتين، وعادة ما يكون سطح البروتين مشحونًا بشكل موحد، ويمكن دمجه مع أعمدة التبادل الكاتيوني/الأنيوني في ظل ظروف معينة. عند تغيير الرقم الهيدروجيني أو استخدام محلول منظم ذو قوة أيونية متزايدة تدريجيًا للشطف، يمكن تبادل المادة المرتبطة مع الأيونات الموجودة في الشاطف وتصفيتها في المحلول. نظرًا لأن المواد المختلفة لها شحنات مختلفة وقدرات ربط مختلفة مع عمود التبادل الأيوني، فإن ترتيب التصفية في المحلول يختلف أيضًا.

(3) تحليل كروماتوغرافي كاره للماء: باستخدام الكارهة للماء للبروتينات، سيتم كشف البقايا الكارهة للماء على سطح البروتينات بعد تمسخها أو في بيئة عالية الملوحة، والبقايا الكارهة للماء من البروتينات المختلفة لها قوة عمل مختلفة مع الروابط الكارهة للماء في الطور الثابت، ويمكن استخدام الكارهة للماء كفصل المكونات الأضعف إلى الأقوى باستخدام القوة الأيونية للشاطف بالترتيب من الأعلى إلى الأقل.

(4) كروماتوغرافيا التقارب: يتم ربط الترابط المحدد للبروتين المراد تنقيته (أو وضع علامة عليه على البروتين) تساهميًا بالجزيء الحامل بالطرق الكيميائية المناسبة. عند إضافة خليط البروتين إلى العمود الكروماتوجرافي المملوء بوسط الألفة، يرتبط البروتين المراد تنقيته بالربيطة على وجه التحديد، في حين لا يتم ربط البروتينات الأخرى وإزالتها عن طريق الغسيل، ويمكن إزالة البروتين المرتبط بشكل خاص بمحلول من الربيطة المقابلة الحرة. يمكن شطف البروتينات المرتبطة بشكل خاص بمحلول يحتوي على المركب الحر المقابل.

4. اختيار ملصقات تنقية البروتين:

خصائص التسميات المختلفة هي كما يلي↓

تنقية علامته: تعد علامته واحدة من العلامات الأكثر استخدامًا، حيث تتم إضافة 6-10 هيستيدين إلى النهاية الأمينية أو الكربوكسيلية للبروتين، ويتم تنقية البروتين المستهدف من خلال قدرته على الارتباط بإحكام بأعمدة خلاب Ni2+ تحت الظروف الطبيعية أو ظروف تغيير الطبيعة (على سبيل المثال، 8M يوريا)، ثم يتم شطفه مع إيميدازول (الذي يتنافس على الارتباط بأيونات النيكل في الآبار الحبيبية).

الكواشف المخبرية:

إيبتج؛ رطل المتوسطة؛

المخزن المؤقت للتحلل: 20 ملي تريس (7.9)، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 10 ملي إيميدازول؛

غسل العازلة: 20 ملي تريس (7.9)، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 20 ملي إيميدازول؛

المخزن المؤقت للشطف: 20 ملم تريس (7.9)، 200 ملم كلوريد الصوديوم، 300 ملم إيميدازول ( يمكن تعديل تركيز إيميدازول وفقًا لكفاءة الشطف )؛

محلول غسيل الكلى: 20 ملي تريس (7.9)، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 10٪ جلسرين؛

حل تلطيخ Kaomas Brilliant Blue؛ محلول إزالة اللون

الأدوات:

Ni-NTA، الكسارة فوق الصوتية، العمود اللوني، أنابيب التركيز

1، بناء بلازميد التعبير بدائيات النواة: تفاعل البوليميراز المتسلسل للجين المستهدف، هضم الناقلات، الربط، التحول، اختيار نسخة واحدة للتسلسل؛

2、تحويل البلازميد الذي تم إنشاؤه بنجاح إلى BL21(DE3)، واحتضانه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل، واختيار النسخة المفردة من أجل اهتزاز صغير طوال الليل؛

3. تحريض صغير لمعرفة أفضل ظروف الحث: سيتم هز المحلول البكتيري طوال الليل 1: 1000 تلقيح في 3 مل LB، 37 درجة مئوية يهز 4-5 ساعات إلى المحلول البكتيري OD600 = 0.6-0.8، إضافة تركيزات مختلفة من IPTG (0.1-1 مم)، درجات حرارة مختلفة، مع خفض درجة الحرارة، يتم تمديد وقت الحث، مثل 37 درجة مئوية المستحثة 4-5 ساعات، 30 درجة مئوية مستحثة 6 ساعات - 8 ساعات، 16 درجة مئوية مستحثة 16-20 ساعة، 16 درجة مئوية مستحثة 16-20 ساعة، يتم تقليل درجة الحرارة، تمديد الوقت، مثل 37 درجة مئوية مستحثة 4-5 ساعات، 30 درجة مئوية مستحثة 6 ساعات -8 ساعات، 16 درجة مئوية مستحثة 16-20 ساعة، يتم تقليل درجة الحرارة. C لمدة 16-20 ساعة، خذ النسغ البكتيري قبل وبعد الحث في ظل ظروف تحريض مختلفة، قم بتشغيل الجل، وصمة عار ومراقبة نتائج الحث؛ (بشكل عام، كلما انخفض تركيز IPTG وانخفضت درجة حرارة الحث، كان التعبير أبطأ عن البروتين المستهدف، وأكثر ملاءمة للطي الصحيح للبروتينات، وبالتالي زيادة قابليتها للذوبان وتقليل توليد الأجسام المتضمنة)

4. بعد العثور على ظروف الحث الأكثر ملاءمة، قم بتطعيم المحلول البكتيري 1: 1000 في 2 لتر من LB، ثم رجه عند 37 درجة مئوية حتى OD600 للمحلول البكتيري = 0.6-0.8، واسحب 20 ميكرولتر من المحلول البكتيري واتركه لتشغيل الجل (1)، ثم حفز تعبير البروتين في ظل ظروف الحث المناسبة التي تم الحصول عليها في التجربة المسبقة، ونضح 20 ميكرولتر من البكتيريا. الحل وتركه لتشغيل الجل (2)؛

5. قم بإزالة السائل البكتيري المستحث، جهاز الطرد المركزي عند 4000 جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية؛

6. تخلص من المادة الطافية، وزن، أضف 10 مل من محلول تحلل التحلل (1: 100 بالإضافة إلى مثبط الأنزيم البروتيني) لكل جرام من البكتيريا، وأعد التعليق، ثم ضعه على الجليد لمدة 30 دقيقة تقريبًا؛

7 、 سحق الضغط: ضع الكحول في الخالط عالي الضغط ، واشطفه بالماء مرتين ، واستخدم محلول Lysis لتحقيق التوازن مرة واحدة ، وأضف السائل البكتيري ، والضغط (يجب ألا يتجاوز الضغط 800 كيلو باسكال) ، والسائل البكتيري أكثر من ثلاث إلى خمس مرات ليصبح شفافًا وغير لزجًا ؛

8. اجمع السائل البكتيري المسحوق، 12000 جم، 4 درجة مئوية بالطرد المركزي لمدة 20 دقيقة، وفصل المادة الطافية والراسبة، واحتفظ بكل عينة بـ 20 ميكرولتر (3) (4) لتشغيل الجل؛

تمت إضافة 9、2 مل Ni-NTA إلى عمود التنقية، ليتم ترشيحه بالإيثانول، وشطفه بالماء، وإضافة محلول Lysis لموازنة العمود؛

10، مع إعادة تعليق Ni-NTA العازلة Lysis إلى المادة الطافية، امزج جيدًا، حضانة شاكر 4 درجات مئوية لمدة ساعتين؛

11. تم تمرير الطاف عبر العمود عند 4 درجات مئوية، وتم جمع 20 ميكرولتر من الترشيح (5)؛

12. اغسل العمود باستخدام محلول غسل 5 مل 3 مرات، واجمع عينة الترشيح 20 ميكرولتر (6)؛

13. أضف 1 مل من محلول الشطف، احتضنه لمدة 5 دقائق، اجمع الشطافة، كرر 5 مرات، اجمع 5 مل من الشطافة في نفس الأنبوب، اترك 20 ميكرولتر من العينة (7)؛

14. تم تشغيل عينات البروتين الفردية التي تم الحصول عليها أثناء التجربة، وصبغها باللون الأزرق اللامع Caumas Brilliant Blue لمدة ساعة واحدة، وتم إزالة لونها حتى أصبح لون الخلفية الأزرق أفتح وكانت أشرطة البروتين واضحة؛

15، قم بتحليل نطاقات البروتين لكل عينة، وفقًا لنتائج العملية اللاحقة: إذا كانت عينات البروتين المستخرجة في البروتين بدون نطاقات متغايرة الزيجوت أو نطاقات متغايرة الزيجوت أو أقل وضحلة، فيمكن غسيل الكلى والتركيز، إذا كانت هناك حاجة إلى تنقية المزيد من النطاقات المتغايرة مرة أخرى بعد غسيل الكلى والتركيز.

16. غسيل الكلى: أضف العينة إلى غشاء غسيل الكلى، وقم بربط كلا الطرفين، وغسيل الكلى عند 4 درجات مئوية خلال الليل؛

17 、 التركيز: وفقًا لحجم الوزن الجزيئي للعينة لاختيار أنبوب التركيز المناسب 4 ℃ تركيز منخفض السرعة، وتركيز قياس تركيز البروتين، ووضع العلامات، في التجميد السريع للنيتروجين السائل، ثم تجميده في الثلاجة -80 ℃.

يوضح الشكل أدناه مخطط kofection لتنقية تقارب البروتين GFP في المختبر، ويتم زيادة نقاء وتركيز البروتين المنقى بشكل كبير