تنقية البروتين    هي عملية إدخال ترميز تسلسل الأحماض النووية للبروتينات في الخلايا المضيفة من خلال تقنيات الهندسة الوراثية ، مما يتسبب في التعبير عنها بكميات كبيرة ، ثم تنقيتها في المختبر باستخدام طرق التنقية المناسبة من أجل الحصول على بروتينات من الطهارة العالية والنشاط والعائد . يمكن تصنيف أنظمة تعبير البروتين إلى أنظمة بدائية النواة وأنظمة حقيقية النواة.

مبادئ وطرق تحفيز تعبير البروتين في الأنظمة بدائية النواة وتنقية البروتينات في المختبر باستخدام كروماتوجرافيا التقارب . فيما يلي

1 、 التنظيم السلبي لمعالج اللاكتوز:

في غياب اللاكتوز ، يكون مناور LAC في حالة من الردع ، في ذلك الوقت يعبر تسلسل I عن بروتين رادع LAC لربط تسلسل O ، ويمنع بوليميريز RNA من الارتباط بتسلسل P وتثبيط بدء النسخ. عند وجود اللاكتوز ، يدخل اللاكتوز الخلية ويتم تحفيزه بواسطة gal-galactosidase ويتم تحويله إلى العزلة ، والذي يرتبط بالبروتين المثبط ، مما يسبب تغييرًا مطابقًا في البروتين ويؤدي إلى تفكك البروتين المثبط من تسلسل O ، وبالتالي بدء نسخ.

يعمل Isopropylthiogalactoside (IPTG) بنفس الطريقة التي تعمل بها Isogalactose وهي محفزة قوية للغاية لا يتم استقلابها بواسطة البكتيريا وهي مستقرة للغاية ، وبالتالي فهي تستخدم على نطاق واسع في المختبرات.

2 、 اختيار إجهاد المضيف:

(1) تعتبر BL21 واحدة من السلالات الأكثر شيوعًا للتعبير بدائية النواة ، والتي هي مناسبة بشكل أساسي للتعبير عن البروتينات غير السامة مع بوليميريز E. coli ، بحيث يمكن تطبيقها على التعبير عن الأنظمة بدائية النواة باستخدام Polymerase E. coli RNA مثل TAC أو TRC (EG pgex ، pmal plasmids).

(2) BL21 (DE3) يدمج جين بوليميريز RNA T7 PHAGE في منطقة de3 phage على كروموسوم سلالة BL21 ، والتي يمكن أن تعبر عن كل من بوليميريز T7 RNA و E. coli RNA polymerase ، ويمكن استخدامها للتعبير عن البلازميدات مثل سلسلة PGEX ، pmal ، وهكذا على.

3 ، طرق تنقية البروتين:

(1) كروماتوجرافيا ترشيح هلام: وفقًا للحجم الجزيئي من الخليط لفصل البروتينات ، وشكل البروتينات المختلفة والحجم الجزيئي للاختلافات في الخليط من خلال عمود ترشيح الهلام ، يختلف الانتشار في الجزيئات المحددة من الجزيئات التي تتراوحها ، فكلما زاد حجم البروتينات المتجهة ، تختلف عن المتجول ، حيث تختلف عن المتجول ، حيث تختلف عن الصيغة ، مما يتوافق على أن تختلف عن الصياد ، مما يزيد من الصلاحية ، على حد سواء. يتم إخراجه من الجزيئات أصغر في وقت لاحق في وقت لاحق شطف.

(2) كروماتوجرافيا تبادل الأيونات: يعتمد فصل البروتين وتنقية على الشحنات المختلفة على سطح البروتين ، وعادة ما يتم شحن سطح البروتين بشكل موحد ، ويمكن دمجه مع أعمدة تبادل الكاتيون/الأنيون في ظل ظروف معينة. عندما يتم تغيير الرقم الهيدروجيني أو يتم استخدام المخزن المؤقت مع القوة الأيونية المتزايدة تدريجياً في شطف ، يمكن تبادل المادة المربوطة مع الأيونات في المحلول وتثبيتها في المحلول. نظرًا لأن المواد المختلفة لها رسوم مختلفة وقدرات ربط مختلفة مع عمود التبادل الأيوني ، فإن ترتيب التخلص من الحل يكون مختلفًا أيضًا.

(3) كروماتوجرافيا مسعور: باستخدام الكارهة للماء للبروتينات ، سيتم تعريض البقايا المسعورة على سطح البروتينات بعد تغيير المسار أو في بيئة ملح عالية ، ويمكن استخدام البقايا الماءة من البروتينات المختلفة من خلال القوة المختلفة من خلال استخدامها من خلال الإرباد المتأثى من الإرباكات المرتفعة من الإرباد المتأثى في الإربات المتصلة بالمرضية. قليل.

(4) تقارب كروماتوجرافيا: يتم توصيل يجند محدد للبروتين المراد تنقيته (أو الموسومة على البروتين) تساهميًا بجزيء الناقل بالطرق الكيميائية المناسبة. عندما تتم إضافة خليط البروتين إلى العمود الكروماتوغرافي المملوء بوسط التقارب ، يرتبط البروتين المراد تنقيته على وجه التحديد بالليجند ، بينما لا يتم ربط البروتينات الأخرى وإزالتها عن طريق الغسيل ، ويمكن التخلص من البروتين المرتبط بالتحديد بمحلول ليجند المجاني. يمكن تهيئة البروتينات المرتبطة على وجه التحديد بمحلول يحتوي على يجند المجاني المقابل.

4 、 اختيار ملصقات تنقية البروتين:

خصائص الملصقات المختلفة هي كما يلي ↓

تنقية TAG: تعتبر ثياب HIS واحدة من أكثر العلامات شيوعًا ، حيث تتم إضافة 6-10 هيتيدين إلى محطة الأمينية أو الكربوكسيل للبروتين ، ويتم تنقية البروتين المستهدف من خلال قدرته على الارتباط بإحكام على الأعمدة NI2+ المخلصة في الظروف الطبيعية (على سبيل المثال ، 8 أمتار يوريا) ، ثم مع إيلامزول (الذي يتنافس عليه.

الكواشف المختبرية:

IPTG ؛ LB متوسطة

تحلل العازلة: 20 ملم تريس (7.9) ، 500 ملم كلوريد الصوديوم ، 10 ملم إيميدازول ؛

المخزن المؤقت لـ Wash: 20 مم Tris (7.9) ، 500 ملم كلوريد الصوديوم ، 20 ملم إيميدازول ؛

العازلة العازلة: 20 مم تريس (7.9) ، 200 ملم كلوريد الصوديوم ، 300 مم إيميدازول ( يمكن ضبط تركيز إيميدازول وفقا لكفاءة شطف ) ؛

محلول غسيل الكلى: 20 ملم تريس (7.9) ، 50 ملم كلوريد الصوديوم ، 10 ٪ الجلسرين ؛

كاوماس حل تلطيخ الأزرق اللامع. حل حل

الآلات:

Ni-NTA ، الكسارة بالموجات فوق الصوتية ، عمود كروماتوجرافيا ، أنابيب التركيز

1 、 بناء البلازميد التعبير بدائية النواة: PCR من الجين المستهدف ، هضم المتجه ، الربط ، التحول ، اختيار استنساخ واحد للتسلسل ؛

2 、 قم بتحويل البلازميد الذي تم إنشاؤه بنجاح إلى BL21 (DE3) ، واحتضان في 37 ℃ بين عشية وضحاها ، واختر استنساخ واحد للهز الصغير بين عشية وضحاها ؛

3 、 تحريض صغير لمعرفة أفضل شروط الحث: سيتم هزها بين عشية وضحاها الحل البكتيري 1: 1000 التلقيح في 3 مل لتر ، 37 ℃ تهتز 4-5H إلى المحلول البكتيري OD600 = 0.6-0.8 ، أضف تركيزات مختلفة من IPT (0.1-1mm) ، مع انخفاض درجة الحرارة ، يتم توسيع وقت الحواف ، مثل 37 ℃ 37 ℃ محفوظ ℃ مستحث 6H-8H ، 16 ℃ المستحث 16-20H ، 16 درجة مئوية 16-20H ، يتم تقليل درجة الحرارة ، يتم تمديد الوقت ، مثل 37 ℃ المستحث 4-5h ، 30 ℃ المستحث 6H-8H ، 16 درجة مئوية 16-20H ، يتم تقليل درجة الحرارة. C لـ 16-20H ، خذ النسغ البكتيرية قبل وبعد الحث في ظل ظروف تحريض مختلفة ، قم بتشغيل الجل ، وصمة عار ومراقبة نتائج الحث ؛ (بشكل عام ، كلما انخفض تركيز IPTG وخفض درجة حرارة الحث ، أبطأ التعبير عن البروتين المستهدف ، وأكثر موات

4 、 بعد العثور على شروط الحث الأنسب ، قم بتطعيم المحلول البكتيري 1: 1000 إلى 2L من LB ، يهز عند 37 ℃ حتى OD600 من المحلول البكتيري = 0.6-0.8 ، نضح 20μL من المحلول البكتيري وتركه لتشغيل الهلام (1) ، ثم تعبير البروتين تحت الحدود المناسبة التي تم الحصول عليها في ما قبل الخليط ، و AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS. اتركه لتشغيل الجل (2) ؛

5 、 قم بإزالة السائل البكتيري المستحث ، الطرد المركزي عند 4000 جم لمدة 15 دقيقة في 4 ℃ ؛

6 、 تجاهل الخافق ، وزن ، أضف العازلة 10 مل (1: 100 زائد مثبط البروتياز) لكل غرام من البكتيريا ، resuspend ، وضع على الجليد لمدة 30 دقيقة تقريبًا ؛

7 、 سحق الضغط: قم بتأجيل الكحول في متجانسة الضغط العالي ، شطف بالماء مرتين ، استخدم محلول تحلل للتوازن مرة واحدة ، أضف السائل البكتيري ، والضغط (يجب ألا يتجاوز الضغط 800 كيلو باهوتة) ، والسائل البكتيري خلال ثلاث مرات إلى الشفافية وليست عصا ؛

8 、 جمع السائل البكتيري المكسر ، 12000 جم ، 4 ℃ الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة ، الفصل الطاف والترسب ، كل عينة 20 ميكرولتر (3) (4) ليتم تشغيل هلام ؛

تمت إضافة 9、2ml Ni-NTA إلى عمود التنقية ، ليتم ترشيح الإيثانول ، وشطفه بالماء ، وأضاف المخزن المؤقت للتحلل لتتوازن العمود ؛

10 、 مع تحلل المخزن المؤقت Ni-NTA resuspension المضافة إلى طاف ، تخلط جيدا ، 4 ℃ الحضانة شاكر لمدة 2H ؛

11 、 تم تمرير طاف عبر العمود عند 4 درجات مئوية ، وتم جمع 20 ميكرولتر من الترشيح (5) ؛

12 、 غسل العمود مع 5 مل من المخزن المؤقت 3 مرات ، اجمع عينة الترشيح 20μL (6) ؛

13 、 أضف 1 مل من المخزن المؤقت شطف 1 مل ، احتضان لمدة 5 دقائق ، اجمع النخبة ، كرر 5 مرات ، وجمع 5 مل من الانبعاث في نفس الأنبوب ، اترك 20 ميكرولتر من العينة (7) ؛

14 、 تم تشغيل عينات البروتين الفردية التي تم الحصول عليها أثناء التجربة ، ملطخة بالأزرق الرائع لمدة 1 ساعة ، وتم إزالة اللون حتى كان اللون الأزرق في الخلفية أخف وزناً ، وكان نطاقات البروتين الصافية مرئية ؛

15 、 قم بتحليل نطاقات البروتين لكل عينة ، وفقًا لنتائج العملية اللاحقة: إذا كانت عينات البروتين المملوءة في البروتين بدون عصابات غير متجانسة أو نطاقات غير متجانسة أو أقل وضحلة ، يمكن أن تكون غسيلًا وتركيزًا ، إذا كان هناك حاجة إلى مزيد من النطاقات غير المتغاير الزيجوت بعد التركيز والتركيز.

16 、 غسيل الكلى: أضف العينة إلى غشاء غسيل الكلى ، المشبك كلا الطرفين ، غسيل الكلى في 4 ℃ بين عشية وضحاها ؛

17 、 التركيز: وفقًا لحجم الوزن الجزيئي للعينة لاختيار أنبوب التركيز المناسب 4 ℃ تركيز منخفض السرعة ، وتركيز قياس تركيز البروتين ، ووضع العلامات ، في تجميد النيتروجين السائل ، ثم تجميدها في الثلاجة -80 ℃.

يوضح الشكل أدناه مؤامرة kofection لتنقية تقارب البروتين GFP في المختبر ، ويتم زيادة نقاء وتركيز البروتين المنقى إلى حد كبير