Purificação de Proteínas    é o processo de introdução de sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas em células hospedeiras através de técnicas de engenharia genética, fazendo com que sejam expressas em grandes quantidades e, em seguida, purificando-as in vitro usando métodos de purificação apropriados, a fim de obter proteínas de alta pureza, atividade e rendimento . Os sistemas de expressão de proteínas podem ser categorizados em sistemas procarióticos e sistemas eucarióticos.

Os princípios e métodos para induzir a expressão proteica em sistemas procarióticos e purificar proteínas in vitro utilizando cromatografia de afinidade são descritos abaixo.

1、Regulação negativa do manipulador de lactose:

Na ausência de lactose, o manipulador lac está em um estado de dissuasão, momento em que a sequência I expressa a proteína dissuasora Lac para se ligar à sequência O, impedindo a RNA polimerase de se ligar à sequência P e inibindo o início da transcrição. Quando a lactose está presente, a lactose entra na célula e é catalisada pela β-galactosidase e convertida em isolactose, que se liga à proteína inibitória, causando uma alteração conformacional na proteína e levando à dissociação da proteína inibitória da sequência O, iniciando assim a transcrição.

O isopropiltiogalactósido (IPTG) atua da mesma forma que a isogalactose e é um indutor extremamente potente que não é metabolizado por bactérias e é muito estável, sendo por isso amplamente utilizado em laboratórios.

2、Seleção de cepa hospedeira:

(1) BL21 é uma das cepas mais comumente usadas para expressão procariótica, que é principalmente adequada para a expressão de proteínas não tóxicas com polimerase de E. coli, portanto pode ser aplicada à expressão de sistemas procarióticos usando RNA polimerase de E. coli, como tac ou trc (por exemplo, plasmídeos pGEX, pMAL).

(2) BL21 (DE3) integra o gene da RNA polimerase do fago T7 na região DE3 do fago λ no cromossomo da cepa BL21, que pode expressar tanto a RNA polimerase de T7 quanto a RNA polimerase de E. coli , e pode ser usada para a expressão de plasmídeos como a série pET, pGEX, pMAL e assim por diante.

3, métodos de purificação de proteínas:

(1) Cromatografia de filtração em gel: de acordo com o tamanho molecular da mistura para separar proteínas, a forma de diferentes proteínas e o tamanho molecular das diferenças na mistura através da coluna de cromatografia de filtração em gel contendo partículas de enchimento, devido ao tamanho molecular de várias proteínas são diferentes, a difusão no tamanho específico das partículas de abertura da capacidade de variar, quanto maiores as moléculas de proteína serão as primeiras a serem eluídas das moléculas são menores quanto mais tarde a eluição.

(2) Cromatografia de troca iônica: a separação e purificação de proteínas é baseada nas diferentes cargas na superfície da proteína, a superfície da proteína é geralmente carregada uniformemente e pode ser combinada com colunas de troca catiônica/aniônica sob certas condições. Quando o pH é alterado ou um tampão com força iônica gradualmente crescente é usado para eluição, a substância ligada pode ser trocada pelos íons no eluente e eluída na solução. Como diferentes substâncias têm diferentes cargas e diferentes capacidades de ligação com a coluna de troca iônica, a ordem de eluição na solução também é diferente.

(3) Cromatografia Hidrofóbica: Usando a hidrofobicidade das proteínas, os resíduos hidrofóbicos serão expostos na superfície das proteínas após a desnaturação ou em um ambiente com alto teor de sal, os resíduos hidrofóbicos de diferentes proteínas têm diferentes forças de ação com os ligantes hidrofóbicos da fase estacionária, e a hidrofobicidade pode ser usada como uma separação de componentes mais fraca para mais forte, usando a força iônica do eluente em ordem de alta para baixa.

(4) Cromatografia de afinidade: o ligante específico de uma proteína a ser purificada (ou marcada na proteína) é ligado covalentemente à molécula transportadora por métodos químicos apropriados. Quando a mistura de proteínas é adicionada à coluna cromatográfica preenchida com meio de afinidade, a proteína a ser purificada é especificamente ligada ao ligante, enquanto as outras proteínas não são ligadas e removidas por lavagem, e a proteína especificamente ligada pode ser eluída com uma solução de ligante correspondente livre. As proteínas especificamente ligadas podem ser eluídas com uma solução contendo o ligando correspondente livre.

4、Seleção de rótulos de purificação de proteínas:

As características dos diferentes rótulos são as seguintes↓

Purificação de etiqueta His: His-tag é uma das etiquetas mais comumente usadas, onde 6-10 histidina são adicionadas ao terminal amino ou carboxila da proteína, e a proteína alvo é purificada por sua capacidade de se ligar firmemente a colunas quelantes de Ni2+ sob condições normais ou desnaturantes (por exemplo, ureia 8M), e então eluída com imidazol (que compete pela ligação a íons de níquel nos poços do grânulo).

Reagentes de laboratório:

IPTG; Meio LB;

Tampão de lise: Tris 20 mM (7,9), NaCl 500 mM, Imidazol 10 mM;

Tampão de lavagem: Tris 20 mM (7,9), NaCl 500 mM, Imidazol 20 mM;

Tampão de eluição: Tris 20mM (7,9), NaCl 200mM, Imidazol 300mM ( a concentração de imidazol pode ser ajustada de acordo com a eficiência de eluição );

Solução de diálise: Tris 20 mM (7,9), NaCl 50 mM, glicerol a 10%;

Solução de coloração Kaomas Brilliant Blue; solução descolorante

Instrumentos:

Ni-NTA, disjuntor ultrassônico, coluna de cromatografia, tubos de concentração

1、Construção de plasmídeo de expressão procariótica: PCR do gene alvo, digestão do vetor, ligação, transformação, escolha de clone único para sequenciamento;

2、Transforme o plasmídeo construído com sucesso em BL21 (DE3), incube a 37 ℃ durante a noite e escolha o clone único para pequena agitação durante a noite;

3、Pequena indução para descobrir as melhores condições de indução: será agitada durante a noite a solução bacteriana 1:1000 inoculação em 3mL LB, 37 ℃ agitando 4-5h para a solução bacteriana OD600 = 0,6-0,8, adicionar diferentes concentrações de IPTG (0,1-1mM), diferentes temperaturas, com a redução da temperatura, o tempo de indução é estendido, como 37 ℃ induzido 4-5h, 30 ℃ induzido 6h-8h, 16 ℃ induzido 16-20h, 16 ° C induzido 16-20h, a temperatura é reduzida, o tempo é estendido, como 37 ℃ induzido 4-5h, 30 ℃ induzido 6h-8h, 16 ° C induzido 16-20h, a temperatura é reduzido. C por 16-20h, retirar a seiva bacteriana antes e depois da indução sob diferentes condições de indução, executar o gel, corar e observar os resultados da indução; (De um modo geral, quanto menor a concentração de IPTG e quanto menor a temperatura de indução, mais lenta a expressão da proteína alvo, mais propícia ao correto dobramento das proteínas, aumentando assim a sua solubilidade e reduzindo a geração de corpos de inclusão)

4、Depois de encontrar as condições de indução mais adequadas, inocule a solução bacteriana 1:1000 em 2L de LB, agite a 37°C até que o OD600 da solução bacteriana = 0,6-0,8, aspire 20μL da solução bacteriana e deixe-a executar o gel (1), em seguida, induza a expressão da proteína sob as condições de indução adequadas obtidas no pré-experimento, e aspire 20μL da solução bacteriana e deixe para passar o gel (2);

5、Remova o líquido bacteriano induzido, centrifugue a 4000g por 15min a 4°C;

6、Descarte o sobrenadante, pese, adicione 10mL de tampão de lise (1:100 mais inibidor de protease) para cada grama de bactéria, ressuspenda, coloque no gelo por cerca de 30min;

7、Esmagamento de pressão: coloque o álcool no homogeneizador de alta pressão, enxágue com água duas vezes, use o tampão de lise para equilibrar uma vez, adicione o líquido bacteriano, pressurização (a pressão não deve exceder 800kpa), o líquido bacteriano mais de três a cinco vezes para transparente e não pegajoso;

8、Colete o líquido bacteriano triturado, 12.000g, centrifugação a 4 ℃ por 20min, o sobrenadante e a separação do precipitado, cada um retendo 20μL de amostra (3) (4) para ser processado em gel;

9、2mL Ni-NTA foi adicionado à coluna de purificação, para ser filtrado com etanol, enxaguado com água e adicionado tampão de lise para equilibrar a coluna;

10、Com ressuspensão de tampão de lise Ni-NTA adicionada ao sobrenadante, misture bem, incubação em agitador de 4 ℃ por 2h;

11、O sobrenadante foi passado pela coluna a 4°C e 20 μL de filtrado foram coletados (5);

12、Lave a coluna com 5mL de tampão de lavagem 3 vezes, colete a amostra do filtrado 20μL (6);

13、Adicionar 1mL de tampão de eluição, incubar por 5min, coletar o eluato, repetir 5 vezes, coletar 5mL de eluato no mesmo tubo, deixar 20μL de amostra (7);

14、As amostras individuais de proteínas obtidas no decorrer do experimento foram analisadas, coradas com Caumas Brilliant Blue por 1h e descoloridas até que a cor azul de fundo fosse mais clara e faixas claras de proteínas fossem visíveis;

15、Analise as bandas de proteína de cada amostra, de acordo com os resultados da operação subsequente: se as amostras de proteína eluídas na proteína sem bandas heterozigóticas ou bandas heterozigóticas ou menos e rasas, podem ser diálise e concentração, se mais bandas heterozigóticas precisarem ser purificadas novamente após diálise e concentração.

16、Diálise: adicione a amostra na membrana de diálise, prenda ambas as extremidades, diálise a 4°C durante a noite;

17、Concentração: de acordo com o tamanho do peso molecular da amostra para escolher o tubo de concentração apropriado 4 ℃ concentração de baixa velocidade, concentração de medição de concentração de proteína, rotulagem, em congelamento rápido de nitrogênio líquido e depois congelado em geladeira de -80 ℃.

A figura abaixo mostra um gráfico de cofecção da purificação por afinidade da proteína GFP in vitro, e a pureza e concentração da proteína purificada são bastante aumentadas