A purificação de proteínas    é o processo de introdução de sequências de ácido nucleico que codificam proteínas nas células hospedeiras através de técnicas de engenharia genética, fazendo com que elas sejam expressas em grandes quantidades e, em seguida, purificando -as in vitro usando métodos de purificação apropriados para obter proteínas de alta pureza, atividade e rendimento . Os sistemas de expressão de proteínas podem ser categorizados em sistemas procarióticos e sistemas eucarióticos.

Os princípios e métodos para induzir a expressão de proteínas em sistemas procarióticos e proteínas purificadoras in vitro usando cromatografia de afinidade são descritas abaixo.

1 、 Regulação negativa do manipulador de lactose:

Na ausência de lactose, o manipulador de lac está em um estado de dissuasão, momento em que a sequência I expressa a proteína de dissuasão lac para se ligar à sequência O, impedindo a ligação da RNA polimerase à sequência P e inibindo o início da transcrição. Quando a lactose está presente, a lactose entra na célula e é catalisada pela β-galactosidase e convertida em isolactose, que se liga à proteína inibitória, causando uma mudança conformacional na proteína e levando à dissociação da proteína inibitória da sequência O, iniciando a transcrição.

A isopropiltiogalactosídeo (IPTG) atua da mesma maneira que a isogalactose e é um indutor extremamente potente que não é metabolizado por bactérias e é muito estável e, portanto, é amplamente utilizado em laboratórios.

2 、 Seleção de tensão do host:

(1) O BL21 é uma das cepas mais usadas para expressão procariótica, que é principalmente adequada para a expressão de proteínas não tóxicas com E. coli polimerase, para que possa ser aplicada à expressão de sistemas procarióticos usando plasmas de E. coli rnA, como TAC ou TRC (GEG PGEX, pmasmides pmal).

(2) O BL21 (DE3) integra o gene T7 FAGE RNA polimerase na região λ fago de3 no cromossomo da cepa BL21, que pode expressar tanto a polimerase de RNA T7 quanto a RNA polimerase de E. coli , e pode ser usada para a expressão de plasmídeos como as séries petrestétricas, PGE, pmal, pmal e assim por.

3, métodos de purificação de proteínas:

(1) Gel filtration chromatography: according to the molecular size from the mixture to separate proteins, the shape of different proteins and the molecular size of the differences in the mixture through the gel filtration chromatography column containing filler particles, due to the molecular size of various proteins are different, the diffusion into the specific size of the aperture particles of the ability to vary, the larger the protein molecules will be the first to ser eluído das moléculas é menor no final da eluição.

(2) Cromatografia em troca de íons: A separação e purificação de proteínas são baseadas nas diferentes cargas na superfície da proteína, a superfície da proteína é geralmente carregada uniformemente e pode ser combinada com colunas de troca de cátions/ânion sob certas condições. Quando o pH é alterado ou um tampão com força iônica aumentada gradualmente é usada para a eluição, a substância ligada pode ser trocada com os íons no eluente e eluída na solução. Como diferentes substâncias têm cargas diferentes e habilidades de ligação diferentes com a coluna de troca iônica, a ordem de ser eluída em solução também é diferente.

(3) Hydrophobic Chromatography: Using the hydrophobicity of proteins, hydrophobic residues will be exposed on the surface of proteins after denaturation or in a high salt environment, the hydrophobic residues of different proteins have different strengths of action with the hydrophobic ligands of the stationary phase, and hydrophobicity can be used as a weakest to strongest component separation by using the ionic strength of the eluent in order from high to baixo.

(4) Cromatografia de afinidade: o ligante específico de uma proteína a ser purificado (ou marcado na proteína) é conectado covalentemente à molécula portadora por métodos químicos apropriados. Quando a mistura de proteínas é adicionada à coluna cromatográfica preenchida com meio de afinidade, a proteína a ser purificada está ligada especificamente ao ligante, enquanto as outras proteínas não são ligadas e removidas pela lavagem, e a proteína ligada especificamente pode ser eluída com uma solução de ligante correspondente livre. As proteínas ligadas especificamente podem ser eluídas com uma solução contendo o ligante correspondente livre.

4 、 Seleção de rótulos de purificação de proteínas:

As características de diferentes rótulos são as seguintes ↓

His-tag purification: His-tag is one of the most commonly used tags, where 6-10 histidine are added to the amino or carboxyl terminus of the protein, and the target protein is purified by its ability to bind tightly to Ni2+ chelating columns under normal or denaturing conditions (eg, 8M urea), and then eluted with imidazole (which competes for binding to nickel ions in the bead wells).

Reagentes de laboratório:

Iptg; Meio lb;

Buffer de lise: Tris 20 mM (7,9), NaCl 500 mM, imidazol 10 mM;

Tampão de lavagem: Tris 20 mM (7,9), NaCl 500 mM, imidazol 20 mM;

Buffer de eluição: 20mm Tris (7,9), NaCl de 200 mm, imidazol de 300 mm ( a concentração de imidazol pode ser ajustada de acordo com a eficiência da eluição );

Solução de diálise: Tris 20 mM (7,9), NaCl 50 mM, 10% de glicerol;

Solução de coloração azul brilhante Kaomas; solução descolorante

Instrumentos:

Ni-NTA, Breaker ultrassônico, coluna de cromatografia, tubos de concentração

1 、 Construção do plasmídeo de expressão procariótica: PCR do gene alvo, digestão vetorial, ligação, transformação, colheita de clone único para sequenciamento;

2 、 Transforme o plasmídeo construído com sucesso em BL21 (DE3), incubado a 37 ℃ durante a noite e escolha o clone único para agitação pequena durante a noite;

3 、 Pequena indução para descobrir as melhores condições de indução: será abalada Solução bacteriana durante a noite 1: 1000 inoculação em 3ml lb, 37 ℃ agitando 4-5h à solução bacteriana od600 = 0,6-0.8, adicione diferentes concentrações de IPTG (0,1-1m), com temperaturas diferentes, com a redução da temperatura, a temperatura é que a temperatura é que a temperatura é uma das temperaturas diferentes, com a temperatura de IPTG (0,1-1 mm), com temperaturas diferentes, com a redução da temperatura. Induzido 6H-8H, 16 ℃ Induzido por 16-20H, 16 ° C induzido por 16-20H, a temperatura é reduzida, o tempo é estendido, como 37 ℃ induzido por 4-5H, 30 ℃ induzido 6H-8H, 16 ° C induzido 16-20H, a temperatura é reduzida. C Por 16-20H, pegue a seiva bacteriana antes e depois da indução sob diferentes condições de indução, execute o gel, mancha e observe os resultados da indução; (De um modo geral, quanto menor a concentração de IPTG e menor a temperatura de indução, mais lenta a expressão da proteína alvo, mais propícia à dobragem correta das proteínas, aumentando assim sua solubilidade e reduzindo a geração de corpos de inclusão)

4 、 Depois de encontrar as condições de indução mais adequadas, inocule a solução bacteriana 1: 1000 em 2L de lb, agite a 37 ℃ até o OD600 da solução bacteriana = 0,6-0,8, aspirado 20μl da solução bacteriana e deixá-lo para executar o gel (1), então induz a expressão da proteína sob a indução sufocada e deixe -o executar o gel (2);

5 、 Remova o líquido bacteriano induzido, centrífuga a 4000g por 15min a 4 ℃;

6 、 Descarte o sobrenadante, pesar, adicione 10 ml de tampão de lise (1: 100 mais inibidor de protease) para cada grama de bactérias, ressuspense, coloque no gelo por cerca de 30 minutos;

7 、 esmagamento de pressão: adie o álcool no homogeneizador de alta pressão, enxágue com água duas vezes, use tampão de lise para equilibrar uma vez, adicione o líquido bacteriano, a pressurização (a pressão não deve exceder 800kpa), o líquido bacteriano acima de três a cinco vezes para transparente e não pegajoso;

8 、 Colete o líquido bacteriano triturado, 12000g, 4 ℃ centrifugação por 20 minutos, a separação sobrenadante e precipitada, cada uma de 20 μl retida (3) (4) para ser executada em gel;

9、2ml Ni-NTA foi adicionado à coluna de purificação, a ser filtrada por etanol, enxaguada com água e adicionada tampão de lise para equilibrar a coluna;

10 、 com tampão de lise, a ressuspensão Ni-NTA adicionada ao sobrenadante, misture bem, 4 ℃ Incubação do agitador por 2H;

11 、 O sobrenadante foi passado através da coluna a 4 ° C e 20 μl de filtrado foi coletado (5);

12 、 Lave a coluna com tampão de lavagem de 5 ml 3 vezes, colete a amostra do filtrado 20μL (6);

13 、 Adicione 1 ml de tampão de eluição, incubado por 5min, colete o eluato, repita 5 vezes, colete 5ml de eluato no mesmo tubo, deixe 20μl de amostra (7);

14 、 As amostras de proteínas individuais obtidas no curso do experimento foram executadas, coradas com caumas azul brilhante por 1H e descoloridas até que a cor azul de fundo fosse mais clara e as bandas de proteínas claras fossem visíveis;

15 、 Analise as faixas de proteínas de cada amostra, de acordo com os resultados da operação subsequente: se as amostras de proteína eluídas na proteína sem bandas heterozigotas ou bandas heterozigotas ou menos e superficiais podem ser dialistas e concentração, se as bandas mais heterozigárias precisarem ser purificadas novamente após a diafália e a concentração.

16 、 Diálise: adicione a amostra na membrana da diálise, prenda as duas extremidades, diálise às 4 ℃ durante a noite;

17 、 Concentração: De acordo com o tamanho do peso molecular da amostra, para escolher o tubo de concentração apropriado 4 ℃ Concentração de baixa velocidade, concentração da medição da concentração de proteínas, marcação, congelamento rápido de nitrogênio líquido e depois congelado em -80 ℃ geladeira.

A figura abaixo mostra um gráfico de kofeção da purificação de afinidade da proteína GFP in vitro, e a pureza e a concentração da proteína purificada são bastante aumentadas