Proteinrening    är processen att introducera nukleinsyrasekvenser som kodar för proteiner i värdceller genom genteknik, vilket får dem att uttryckas i stora mängder, och sedan rena dem in vitro med lämpliga reningsmetoder för att erhålla proteiner med hög renhet, aktivitet och avkastning . Proteinexpressionssystem kan kategoriseras i prokaryota system och eukaryota system.

Principerna och metoderna för att inducera proteinuttryck i prokaryota system och rena proteiner in vitro med användning av affinitetskromatografi beskrivs nedan.

1, Negativ reglering av laktosmanipulatorn:

I frånvaro av laktos är lac-manipulatorn i ett avskräckande tillstånd, vid vilken tidpunkt I-sekvensen uttrycker Lac-avskräckningsproteinet för att binda till O-sekvensen, vilket förhindrar RNA-polymeras från att binda till P-sekvensen och inhiberar transkriptionsinitiering. När laktos är närvarande kommer laktos in i cellen och katalyseras av β-galaktosidas och omvandlas till isolaktos, som binder till det hämmande proteinet, vilket orsakar en konformationsförändring i proteinet och leder till dissociering av det hämmande proteinet från O-sekvensen, vilket initierar transkription.

Isopropyltiogalaktosid (IPTG) verkar på samma sätt som isogalaktos och är en extremt potent inducerare som inte metaboliseras av bakterier och är mycket stabil och används därför flitigt i laboratorier.

2, val av värdstam:

(1) BL21 är en av de mest använda stammarna för prokaryot uttryck, som främst är lämpligt för uttryck av icke-toxiska proteiner med E. coli-polymeras, så det kan appliceras på uttryck av prokaryota system med E. coli RNA-polymeras såsom tac eller trc (t.ex. pGEX, pMAL-plasmider).

(2) BL21(DE3) integrerar T7-fag-RNA-polymerasgenen i λ-fag DE3-regionen på kromosomen av BL21-stammen, som kan uttrycka både T7-RNA-polymeras och E. coli RNA-polymeras och kan användas för uttryck av plasmider såsom pET-serien, pGEX, pGEX, pGEX, p.MAL

3, proteinreningsmetoder:

(1) Gelfiltreringskromatografi: beroende på molekylstorleken från blandningen för att separera proteiner, formen på olika proteiner och molekylstorleken för skillnaderna i blandningen genom gelfiltreringskromatografikolonnen som innehåller fyllmedelspartiklar, på grund av att molekylstorleken hos olika proteiner är olika, kommer diffusionen till den specifika storleken på öppningspartikeln att vara större och molekylen av öppningspartiklarna varierar större. först som elueras ut ur molekylerna är mindre ju senare ju senare elueringen.

(2) Jonbyteskromatografi: proteinseparation och rening baseras på de olika laddningarna på ytan av proteinet, proteinets yta är vanligtvis enhetligt laddad och kan kombineras med katjon/anjonbytarkolonner under vissa förhållanden. När pH ändras eller en buffert med gradvis ökande jonstyrka används för eluering, kan den bundna substansen bytas ut mot jonerna i eluenten och elueras i lösningen. Eftersom olika ämnen har olika laddningar och olika bindningsförmåga med jonbytarkolonnen, är ordningen för eluering i lösning också olika.

(3) Hydrofob kromatografi: Med hjälp av proteiners hydrofobicitet kommer hydrofoba rester att exponeras på ytan av proteiner efter denaturering eller i en miljö med hög salthalt, de hydrofoba resterna av olika proteiner har olika verkningsstyrka med de hydrofoba liganderna i den stationära fasen, och hydrofobiciteten kan användas som den svagaste komponenten för separation av den svagaste styrkan. i ordning från högt till lågt.

(4) Affinitetskromatografi: den specifika liganden för ett protein som ska renas (eller märkas på proteinet) fästs kovalent till bärarmolekylen med lämpliga kemiska metoder. När proteinblandningen tillsätts till den kromatografiska kolonnen fylld med affinitetsmedium, binds proteinet som ska renas specifikt till liganden, medan de andra proteinerna inte binds och avlägsnas genom tvättning, och det specifikt bundna proteinet kan elueras bort med en lösning av fri motsvarande ligand. De specifikt bundna proteinerna kan elueras med en lösning innehållande den fria motsvarande liganden.

4、Utval av proteinreningsetiketter:

De olika etiketternas egenskaper är följande↓

His-tag-rening: His-tag är en av de mest använda taggar, där 6-10 histidin tillsätts till amino- eller karboxylterminalen av proteinet, och målproteinet renas genom sin förmåga att binda tätt till Ni2+-kelatkolonner under normala eller denaturerande förhållanden (t.ex. 8M urea), och sedan elueras med imidazoljoner (med nickel) pärlbrunnar).

Laboratoriereagens:

IPTG; LB-medium;

Lysbuffert: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 10 mM imidazol;

Tvättbuffert: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 20 mM imidazol;

Elueringsbuffert: 20 mM Tris (7,9), 200 mM NaCl, 300 mM imidazol ( Imidazolkoncentrationen kan justeras enligt elueringseffektiviteten );

Dialyslösning: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10 % glycerol;

Kaomas Brilliant Blue färgningslösning; avfärgande lösning

Instrument:

Ni-NTA, ultraljudsbrytare, kromatografikolonn, koncentrationsrör

1、Konstruktion av prokaryot uttrycksplasmid: PCR av målgenen, vektornedbrytning, ligering, transformation, plockning av en enda klon för sekvensering;

2、Transformera den framgångsrikt konstruerade plasmiden till BL21(DE3), inkubera vid 37 ℃ över natten och välj den enda klonen för liten skakning över natten;

3、Små induktion för att ta reda på de bästa induktionsförhållandena: kommer att skakas över natten bakteriell lösning 1:1000 inokulering i 3mL LB, 37 ℃ skakning 4-5h till bakterielösningen OD600 = 0,6-0,8, lägg till olika koncentrationer av IPTG (0,1-1mM), sänkning av temperaturen förlängs, med, sänkning av temperaturen, såsom 37 ℃ inducerad 4-5h, 30 ℃ inducerad 6h-8h, 16 ℃ inducerad 16-20h, 16°C inducerad 16-20h, temperaturen sänks, tiden förlängs, såsom 37 ℃ inducerad 30 ℃ inducerad 4-5h, - 6h ° C inducerad 16-20h, sänks temperaturen. C i 16-20h, ta bakteriesaften före och efter induktion under olika induktionsförhållanden, kör gelen, färga och observera resultaten av induktionen; (Generellt sett, ju lägre koncentration av IPTG och ju lägre induktionstemperatur, desto långsammare uttrycket av målproteinet, desto mer gynnsamt för korrekt veckning av proteiner, vilket ökar deras löslighet och minskar genereringen av inklusionskroppar)

4、 Efter att ha hittat de mest lämpliga induktionsförhållandena, ympa bakterielösningen 1:1000 i 2L LB, skaka vid 37 ℃ tills OD600 för bakterielösningen = 0,6-0,8, aspirera 20 μL av bakterielösningen och låt den köra i det erhållna gelinduktionsproteinet (1) förexperimentera och aspirera 20μL av bakterielösningen och låt den köra gelén (2);

5、Ta bort den inducerade bakterievätskan, centrifugera vid 4000g i 15 minuter vid 4℃;

6、Kassera supernatanten, väg, tillsätt 10mL lyseringsbuffert (1:100 plus proteashämmare) för varje gram bakterier, återsuspendera, lägg på is i cirka 30 minuter;

7、 Tryckkrossning: lägg av alkoholen i högtryckshomogenisatorn, skölj med vatten två gånger, använd lyseringsbuffert för att balansera en gång, tillsätt bakterievätskan, trycksättning (trycket bör inte överstiga 800kpa), bakterievätskan över tre till fem gånger till transparent och inte klibbig;

8、 Samla upp den krossade bakterievätskan, 12000g, 4 ℃ centrifugering i 20 minuter, supernatanten och fällningen separering, vardera behållit 20μL prov (3) (4) för att köras gel;

9,2 mL Ni-NTA tillsattes till reningskolonnen, för att etanolfiltreras, sköljas med vatten och tillsattes lysbuffert för att jämvikta kolonnen;

10、Med lyseringsbuffert Ni-NTA-resuspension tillsatt till supernatanten, blanda väl, 4 ℃ shakerinkubation i 2 timmar;

11、Supernatanten fick passera genom kolonnen vid 4°C och 20 μL filtrat samlades upp (5);

12、Tvätta kolonnen med 5mL tvättbuffert 3 gånger, samla upp filtratprovet 20μL (6);

13、Tillsätt 1 ml elueringsbuffert, inkubera i 5 minuter, samla upp eluatet, upprepa 5 gånger, samla upp 5 ml eluat i samma rör, lämna 20 μL prov (7);

14、De individuella proteinproverna som erhölls under experimentets gång kördes, färgades med Caumas Brilliant Blue i 1 timme och avfärgades tills den blå bakgrundsfärgen var ljusare och tydliga proteinband var synliga;

15、 Analysera proteinbanden för varje prov, enligt resultaten av den efterföljande operationen: om de eluerade proteinproverna i proteinet utan heterozygota band eller heterozygota band eller mindre och grunda, kan dialys och koncentration, om fler heterozygota band behöver renas igen efter dialys och koncentration.

16、Dialys: lägg till provet i dialysmembranet, klämma fast båda ändarna, dialys vid 4℃ över natten;

17、Koncentration: enligt provets molekylviktsstorlek för att välja lämplig koncentrationsrör 4 ℃ låghastighetskoncentration, koncentration av proteinkoncentration mätning, märkning, i flytande kväve snabbfrysning och sedan fryst i -80 ℃ kylskåp.

Figuren nedan visar en kofektionsplot av GFP-proteinaffinitetsrening in vitro, och renheten och koncentrationen av det renade proteinet ökar kraftigt