Proteinrening    är processen för att införa nukleinsyrasekvenser som kodar för proteiner i värdceller genom gentekniska tekniker, vilket får dem att uttryckas i stora mängder och sedan rena dem in vitro med användning av lämpliga reningsmetoder för att erhålla proteiner med hög renhet, aktivitet och utbyte . Proteinuttryckssystem kan kategoriseras i prokaryota system och eukaryota system.

Principerna och metoderna för att inducera proteinuttryck i prokaryota system och rena proteiner in vitro med användning av affinitetskromatografi beskrivs nedan.

1 、 Negativ reglering av laktosmanipulatorn:

I frånvaro av laktos är LAC -manipulatorn i ett tillstånd av avskräckande, vid vilken tidpunkt I -sekvensen uttrycker LAC -avskräckningsproteinet för att binda till O -sekvensen, vilket förhindrar RNA -polymeras från att binda till P -sekvensen och hämma transkriptionsinitiering. När laktos är närvarande, kommer laktos in i cellen och katalyseras av p-galaktosidas och omvandlas till isolaktos, som binder till det hämmande proteinet, vilket orsakar en konformationell förändring i proteinet och leder till dissociation av det hämmande proteinet från O-sekvensen, och därmed initierar transkription.

Isopropyltiogalaktosid (IPTG) verkar på samma sätt som isogalaktos och är en extremt potent inducerare som inte metaboliseras av bakterier och är mycket stabil och används därför allmänt i laboratorier.

2 、 Val av värdstam:

(1) BL21 är en av de mest använda stammarna för prokaryotiskt uttryck, som huvudsakligen är lämpligt för expression av icke-toxiska proteiner med E. coli-polymeras, så det kan appliceras på expression av prokaryotiska system med användning av E. coli RNA-polymeras såsom TAC eller TRC (EG pGEx, PMAL-plasmider).

(2) BL21 (DE3) integrerar T7 -fag -RNA -polymerasgenen i λ -fag de3 -regionen på kromosomen av BL21 -stam, som kan uttrycka både T7 RNA -polymeras och E. coli RNA -polymeras , och kan användas för uttryck av plasmider såsom PET -serien, pgex, pmal och så på.

3, proteinreningsmetoder:

(1) Gel filtration chromatography: according to the molecular size from the mixture to separate proteins, the shape of different proteins and the molecular size of the differences in the mixture through the gel filtration chromatography column containing filler particles, due to the molecular size of various proteins are different, the diffusion into the specific size of the aperture particles of the ability to vary, the larger the protein molecules will be the first to be eluerade ur molekylerna är mindre desto senare eluering.

(2) Jonutbyteskromatografi: Proteinseparation och rening är baserad på de olika laddningarna på proteinets yta, proteinets yta är vanligtvis enhetligt laddad och kan kombineras med katjonutbyteskolonner under vissa förhållanden. När pH ändras eller en buffert med gradvis ökande jonstyrka används för eluering, kan det bundna substansen utbytas med jonerna i eluentet och elueras in i lösningen. Eftersom olika ämnen har olika laddningar och olika bindningsförmågor med jonbytarkolumnen är ordningen att elueras till lösning också annorlunda.

(3) Hydrophobic Chromatography: Using the hydrophobicity of proteins, hydrophobic residues will be exposed on the surface of proteins after denaturation or in a high salt environment, the hydrophobic residues of different proteins have different strengths of action with the hydrophobic ligands of the stationary phase, and hydrophobicity can be used as a weakest to strongest component separation by using the ionic strength of the eluent in order from high to låg.

(4) Affinitetskromatografi: Den specifika liganden av ett protein som ska renas (eller taggas på proteinet) är kovalent fäst vid bärarmolekylen med lämpliga kemiska metoder. När proteinblandningen tillsätts till den kromatografiska kolonnen fylld med affinitetsmedium, är proteinet som ska renas specifikt bundet till liganden, medan de andra proteinerna inte är bundna och avlägsnas genom tvätt, och det specifikt bundna proteinet kan elueras med en lösning av fritt motsvarande ligand. De specifikt bundna proteinerna kan elueras med en lösning som innehåller den fria motsvarande liganden.

4 、 Val av proteinreningetiketter:

Egenskaperna hos olika etiketter är följande ↓

His-tag purification: His-tag is one of the most commonly used tags, where 6-10 histidine are added to the amino or carboxyl terminus of the protein, and the target protein is purified by its ability to bind tightly to Ni2+ chelating columns under normal or denaturing conditions (eg, 8M urea), and then eluted with imidazole (which competes for binding to nickel ions in the bead wells).

Laboratorieflöpare:

Iptg; Lb medium;

Lysbuffert: 20 mM Tris (7.9), 500 mM NaCl, 10 mM imidazol;

Tvättbuffert: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 20 mM imidazol;

Elueringsbuffert: 20 mm Tris (7.9), 200 mm NaCl, 300 mm imidazol ( imidazolkoncentration kan justeras enligt elueringseffektiviteten );

Dialyslösning: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10% glycerol;

Kaomas lysande blå färgningslösning; blekningslösning

Instrument:

Ni-NTA, Ultrasonic Breaker, Chromatography Column, Concentration Tubes

1 、 Konstruktion av prokaryotisk expressionsplasmid: PCR för målgen, vektor -matsmältning, ligering, transformation, plockning av enstaka klon för sekvensering;

2 、 Förvandla den framgångsrika konstruerade plasmiden till BL21 (DE3), inkubera vid 37 ℃ över natten och välj den enda klonen för liten skakning över natten;

3、Small induction to find out the best induction conditions: will be shaken overnight bacterial solution 1:1000 inoculation into 3mL LB, 37 ℃ shaking 4-5h to the bacterial solution OD600 = 0.6-0.8, add different concentrations of IPTG (0.1-1mM), different temperatures, with the lowering of the temperature, induction time is extended, such as 37 ℃ induced 4-5h, 30 ℃ inducerad 6H-8H, 16 ℃ inducerad 16-20H, 16 ° C inducerad 16-20H, temperaturen reduceras, tiden förlängs, såsom 37 ℃ inducerad 4-5H, 30 ℃ inducerad 6H-8H, 16 ° C inducerad 16-20H, temperaturen reduceras. C För 16-20 timmar, ta bakteriesapen före och efter induktion under olika induktionsförhållanden, kör gelén, fläckar och observera resultaten av induktion; (Generellt sett, ju lägre koncentrationen av IPTG och ju lägre induktionstemperatur, desto långsammare uttryck av målproteinet, desto mer gynnsam för rätt vikning av proteiner, vilket ökar deras löslighet och minskar genereringen av inkluderingskroppar)

4、After finding the most suitable induction conditions, inoculate the bacterial solution 1:1000 into 2L of LB, shake at 37℃ until the OD600 of the bacterial solution=0.6-0.8, aspirate 20μL of the bacterial solution and leave it to run the gel (1), then induce the protein expression under the suitable induction conditions obtained in the pre-experiment, and aspirate 20μL of the bacterial solution och lämna den för att köra gelén (2);

5 、 Ta bort den inducerade bakterievätskan, centrifug vid 4000 g under 15 minuter vid 4 ℃;

6 、 Kassera supernatanten, väga, tillsätt 10 ml lysbuffert (1: 100 plus proteasinhibitor) för varje gram bakterier, resuspendera, placera på is i cirka 30 minuter;

7 、 Tryckkrossning: Sätt av alkoholen i högtryckshomogenisatorn, skölj med vatten två gånger, använd lysbuffert för att balansera en gång, tillsätt bakterievätskan, trycksignal (trycket bör inte överstiga 800 kPa), bakterievätskan över tre till fem gånger till transparent och inte klibbig;

8 、 Samla den krossade bakterievätskan, 12000g, 4 ℃ centrifugering under 20 minuter, supernatanten och utfällningsseparationen, var och en bibehöll 20 ul prov (3) (4) för att köras gel;

9、2ml Ni-NTA sattes till reningskolonnen, för att vara etanolfiltrerad, sköljdes med vatten och tillsatt lysbuffert för att jämviktas kolonnen;

10 、 Med lysbuffert Ni-NTA-resuspension tillagd till supernatanten, blanda väl, 4 ℃ Shaker inkubation för 2H;

11 、 Supernatanten passerade genom kolonnen vid 4 ° C och 20 ul filtrat uppsamlades (5);

12 、 Tvätta kolumnen med 5 ml tvättbuffert 3 gånger, samla filtratprovet 20 ul (6);

13 、 Tillsätt 1 ml elueringsbuffert, inkubera i 5 minuter, samla in eluatet, upprepa 5 gånger, samla 5 ml eluat i samma rör, lämna 20 ul prov (7);

14 、 De enskilda proteinproverna erhållna under experimentet kördes, färgades med caumas lysande blått under 1 timme och avfärgades tills bakgrundsblå färgen var lättare och tydliga proteinband var synliga;

15 、 Analysera proteinbanden för varje prov, enligt resultaten från den efterföljande operationen: Om de eluerade proteinproverna i proteinet utan heterozygota band eller heterozygota band eller mindre och grunt, kan vara dialys och koncentration, om mer heterozygösa band behöver för att renificeras igen efter dialys och koncentration.

16 、 Dialys: Tillsätt provet i dialysmembranet, klämma båda ändarna, dialys vid 4 ℃ över natten;

17 、 Koncentration: Enligt molekylviktstorleken för provet för att välja lämpligt koncentrationsrör 4 ℃ låg hastighetskoncentration, koncentration av proteinkoncentrationsmätning, märkning, i flytande kväve-frysning och sedan fryst i -80 ℃ Kylskåp.

Figuren nedan visar en kofektionsplott av GFP -proteinaffinitetsrening in vitro, och renheten och koncentrationen av det renade proteinet ökas kraftigt kraftigt