प्रोटीन शुद्धिकरण    आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीकों के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं में प्रोटीन के लिए न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम कोडिंग शुरू करने की प्रक्रिया है, जिससे उन्हें बड़ी मात्रा में व्यक्त किया जाता है, और फिर उच्च शुद्धता, गतिविधि और उपज के प्रोटीन प्राप्त करने के लिए उचित शुद्धिकरण विधियों का उपयोग करके उन्हें इन विट्रो में शुद्ध किया जाता है । प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों को प्रोकैरियोटिक प्रणालियों और यूकेरियोटिक प्रणालियों में वर्गीकृत किया जा सकता है.

के सिद्धांत और तरीके प्रोकैरियोटिक प्रणालियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने और एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके इन विट्रो में प्रोटीन को शुद्ध करने नीचे वर्णित हैं।

1、लैक्टोज मैनिपुलेटर का नकारात्मक विनियमन:

लैक्टोज की अनुपस्थिति में, लैक मैनिपुलेटर निरोध की स्थिति में होता है, जिस समय I अनुक्रम ओ अनुक्रम से जुड़ने के लिए लैक निवारक प्रोटीन को व्यक्त करता है, आरएनए पोलीमरेज़ को पी अनुक्रम से बंधने से रोकता है और प्रतिलेखन दीक्षा को रोकता है। जब लैक्टोज मौजूद होता है, तो लैक्टोज कोशिका में प्रवेश करता है और β-गैलेक्टोसिडेज़ द्वारा उत्प्रेरित होता है और आइसोलैक्टोज में परिवर्तित हो जाता है, जो निरोधात्मक प्रोटीन से जुड़ जाता है, जिससे प्रोटीन में एक गठनात्मक परिवर्तन होता है और ओ अनुक्रम से निरोधात्मक प्रोटीन का पृथक्करण होता है, जिससे प्रतिलेखन शुरू होता है।

आइसोप्रोपाइलथियोगैलेक्टोसाइड (आईपीटीजी) आइसोगैलेक्टोज की तरह ही कार्य करता है और एक अत्यंत शक्तिशाली प्रेरक है जो बैक्टीरिया द्वारा चयापचय नहीं किया जाता है और बहुत स्थिर है, और इसलिए प्रयोगशालाओं में इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

2、मेजबान तनाव चयन:

(1) बीएल21 प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले उपभेदों में से एक है, जो मुख्य रूप से ई. कोली पोलीमरेज़ के साथ गैर विषैले प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है , इसलिए इसे टीएसी या टीआरसी (जैसे पीजीईएक्स, पीएमएएल प्लास्मिड) जैसे ई. कोली आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके प्रोकैरियोटिक सिस्टम की अभिव्यक्ति पर लागू किया जा सकता है।

(2) बीएल21(डीई3) बीएल21 स्ट्रेन के गुणसूत्र पर λ फेज डीई3 क्षेत्र में टी7 फेज आरएनए पोलीमरेज़ जीन को एकीकृत करता है, जो टी7 आरएनए पोलीमरेज़ और ई. कोली आरएनए पोलीमरेज़ दोनों को व्यक्त कर सकता है, और पीईटी श्रृंखला, पीजीईएक्स, पीएमएएल इत्यादि जैसे प्लास्मिड की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

3, प्रोटीन शुद्धि विधियाँ:

(1) जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी: मिश्रण से आणविक आकार के अनुसार प्रोटीन को अलग करने के लिए, विभिन्न प्रोटीनों के आकार और मिश्रण में अंतर के आणविक आकार के अनुसार जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी कॉलम के माध्यम से भराव कण होते हैं, विभिन्न प्रोटीनों के आणविक आकार के कारण अलग-अलग होते हैं, एपर्चर कणों के विशिष्ट आकार में भिन्नता की क्षमता होती है, प्रोटीन अणु जितना बड़ा होगा अणुओं से बाहर निकलने वाला पहला होगा, बाद में क्षालन उतना ही छोटा होगा।

(2) आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी: प्रोटीन पृथक्करण और शुद्धिकरण प्रोटीन की सतह पर विभिन्न आवेशों पर आधारित होता है, प्रोटीन की सतह आमतौर पर समान रूप से आवेशित होती है, और कुछ शर्तों के तहत इसे धनायन/आयनों विनिमय स्तंभों के साथ जोड़ा जा सकता है। जब पीएच को बदल दिया जाता है या धीरे-धीरे बढ़ती आयनिक शक्ति के साथ एक बफर का उपयोग निक्षालन के लिए किया जाता है, तो बंधे हुए पदार्थ को निक्षालन में आयनों के साथ आदान-प्रदान किया जा सकता है और घोल में डाला जा सकता है। चूंकि अलग-अलग पदार्थों में अलग-अलग चार्ज होते हैं और आयन एक्सचेंज कॉलम के साथ अलग-अलग बंधन क्षमता होती है, इसलिए समाधान में उत्सर्जित होने का क्रम भी अलग होता है।

(3) हाइड्रोफोबिक क्रोमैटोग्राफी: प्रोटीन की हाइड्रोफोबिसिटी का उपयोग करते हुए, हाइड्रोफोबिक अवशेषों को विकृतीकरण के बाद या उच्च नमक वातावरण में प्रोटीन की सतह पर उजागर किया जाएगा, विभिन्न प्रोटीनों के हाइड्रोफोबिक अवशेषों में स्थिर चरण के हाइड्रोफोबिक लिगैंड के साथ कार्रवाई की अलग-अलग ताकत होती है, और हाइड्रोफोबिसिटी का उपयोग उच्च से निम्न क्रम में एलुएंट की आयनिक ताकत का उपयोग करके सबसे कमजोर से सबसे मजबूत घटक पृथक्करण के रूप में किया जा सकता है।

(4) एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी: शुद्ध किए जाने वाले प्रोटीन के विशिष्ट लिगैंड को उचित रासायनिक तरीकों से वाहक अणु से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जाता है (या प्रोटीन पर टैग किया जाता है)। जब प्रोटीन मिश्रण को आत्मीयता माध्यम से भरे क्रोमैटोग्राफिक कॉलम में जोड़ा जाता है, तो शुद्ध किया जाने वाला प्रोटीन विशेष रूप से लिगैंड से बंधा होता है, जबकि अन्य प्रोटीन बंधे नहीं होते हैं और धोने से हटा दिए जाते हैं, और विशेष रूप से बंधे प्रोटीन को मुक्त संगत लिगैंड के समाधान के साथ हटाया जा सकता है। विशेष रूप से बंधे प्रोटीन को मुक्त संगत लिगैंड वाले घोल से साफ किया जा सकता है।

4、प्रोटीन शुद्धि लेबल का चयन:

विभिन्न लेबलों की विशेषताएँ इस प्रकार हैं↓

हिज़-टैग शुद्धि: हिज़-टैग सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले टैगों में से एक है, जहां प्रोटीन के अमीनो या कार्बोक्सिल टर्मिनस में 6-10 हिस्टिडाइन जोड़े जाते हैं, और लक्ष्य प्रोटीन को सामान्य या विकृतीकरण स्थितियों (उदाहरण के लिए, 8 एम यूरिया) के तहत Ni2+ चेलेटिंग कॉलम से कसकर बांधने की क्षमता से शुद्ध किया जाता है, और फिर इमिडाज़ोल (जो मनका कुओं में निकल आयनों को बांधने के लिए प्रतिस्पर्धा करता है) के साथ शुद्ध किया जाता है।

प्रयोगशाला अभिकर्मक:

आईपीटीजी; एलबी माध्यम;

लाइसिस बफर: 20 मिमी ट्रिस (7.9), 500 मिमी NaCl, 10 मिमी इमिडाज़ोल;

वॉश बफर: 20 एमएम ट्रिस (7.9), 500 एमएम NaCl, 20 एमएम इमिडाज़ोल;

रेफरेंस बफर: 20 मिमी ट्रिस (7.9), 200 मिमी NaCl, 300 मिमी इमिडाज़ोल ( इमिडाज़ोल एकाग्रता को रेफरेंस दक्षता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है );

डायलिसिस समाधान: 20 एमएम ट्रिस (7.9), 50 एमएम NaCl, 10% ग्लिसरॉल;

काओमास ब्रिलियंट ब्लू धुंधला समाधान; रंग हटाने का घोल

उपकरण:

नी-एनटीए, अल्ट्रासोनिक ब्रेकर, क्रोमैटोग्राफी कॉलम, एकाग्रता ट्यूब

1、प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति प्लास्मिड का निर्माण: लक्ष्य जीन का पीसीआर, वेक्टर पाचन, बंधाव, परिवर्तन, अनुक्रमण के लिए एकल क्लोन चुनना;

2、सफलतापूर्वक निर्मित प्लास्मिड को BL21(DE3) में बदलें, रात भर 37℃ पर सेते रहें, और रात भर छोटे झटकों के लिए एकल क्लोन चुनें;

3、सर्वोत्तम प्रेरण स्थितियों का पता लगाने के लिए लघु प्रेरण: रात भर जीवाणु समाधान को हिलाया जाएगा 1: 3 एमएल एलबी में 1000 टीकाकरण, 37 ℃ जीवाणु समाधान ओडी 600 = 0.6-0.8 में 4-5 घंटे मिलाते हुए, आईपीटीजी (0.1-1 मिमी) के विभिन्न सांद्रता जोड़ें, तापमान कम होने के साथ अलग-अलग तापमान, प्रेरण समय बढ़ाया जाता है, जैसे कि 37 ℃ 4-5 घंटे प्रेरित, 30 ℃ प्रेरित 6 घंटे-8 घंटे, 16 ℃ प्रेरित 16-20 घंटे, 16 डिग्री सेल्सियस प्रेरित 16-20 घंटे, तापमान कम हो जाता है, समय बढ़ाया जाता है, जैसे 37 ℃ प्रेरित 4-5 घंटे, 30 ℃ प्रेरित 6 घंटे-8 घंटे, 16 डिग्री सेल्सियस प्रेरित 16-20 घंटे, तापमान कम हो गया है. सी 16-20 घंटों के लिए, विभिन्न प्रेरण स्थितियों के तहत प्रेरण से पहले और बाद में जीवाणु रस लें, जेल चलाएं, दाग दें और प्रेरण के परिणामों का निरीक्षण करें; (आम तौर पर कहें तो, आईपीटीजी की सांद्रता जितनी कम होगी और प्रेरण तापमान जितना कम होगा, लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति उतनी ही धीमी होगी, प्रोटीन की सही तह के लिए उतना ही अनुकूल होगा, जिससे उनकी घुलनशीलता बढ़ेगी और समावेशन निकायों की पीढ़ी कम हो जाएगी)

4、सबसे उपयुक्त प्रेरण स्थितियों को ढूंढने के बाद, जीवाणु समाधान 1: 1000 को एलबी के 2 एल में टीका लगाएं, जीवाणु समाधान के ओडी 600 = 0.6-0.8 तक 37 ℃ पर हिलाएं, जीवाणु समाधान के 20μL को एस्पिरेट करें और इसे जेल चलाने के लिए छोड़ दें (1), फिर पूर्व-प्रयोग में प्राप्त उपयुक्त प्रेरण स्थितियों के तहत प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें, और 20μL को एस्पिरेट करें जीवाणु समाधान और इसे जेल चलाने के लिए छोड़ दें (2);

5、प्रेरित जीवाणु तरल निकालें, 4000 ग्राम को 4℃ पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें;

6、सतह पर तैरनेवाला हटाएं, तौलें, प्रत्येक ग्राम बैक्टीरिया के लिए 10 एमएल लाइसिस बफर (1:100 प्लस प्रोटीज अवरोधक) जोड़ें, फिर से निलंबित करें, लगभग 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें;

7、प्रेशर क्रशिंग: अल्कोहल को हाई-प्रेशर होमोजेनाइज़र में डालें, पानी से दो बार धोएं, एक बार संतुलन बनाने के लिए लाइसिस बफर का उपयोग करें, बैक्टीरियल लिक्विड डालें, दबाव डालें (दबाव 800kpa से अधिक नहीं होना चाहिए), बैक्टीरियल लिक्विड को तीन से पांच बार पारदर्शी और चिपचिपा न होने दें;

8、कुचल बैक्टीरिया तरल, 12000 ग्राम, 20 मिनट के लिए 4 ℃ सेंट्रीफ्यूजेशन, सतह पर तैरनेवाला और अवक्षेप पृथक्करण, प्रत्येक 20μL नमूना (3) (4) को जेल चलाने के लिए इकट्ठा करें;

9、2mL Ni-NTA को शुद्धि स्तंभ में जोड़ा गया, इथेनॉल को फ़िल्टर किया गया, पानी से धोया गया, और स्तंभ को संतुलित करने के लिए Lysis बफर जोड़ा गया;

10、लिसिस बफर नी-एनटीए पुनर्निलंबन के साथ सतह पर तैरनेवाला में जोड़ा गया, अच्छी तरह से मिलाएं, 2 घंटे के लिए 4 ℃ शेकर ऊष्मायन;

11、सतह पर तैरनेवाला 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ के माध्यम से पारित किया गया था, और 20 μL निस्पंद एकत्र किया गया था (5);

12、कॉलम को 5एमएल वॉश बफर से 3 बार धोएं, छानने का नमूना 20μL (6) एकत्र करें;

13、1 एमएल एलुएट बफर जोड़ें, 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, एलुएट इकट्ठा करें, 5 बार दोहराएं, एक ही ट्यूब में 5 एमएल एलुएट इकट्ठा करें, 20μL नमूना छोड़ें (7);

14、प्रयोग के दौरान प्राप्त व्यक्तिगत प्रोटीन नमूनों को चलाया गया, 1 घंटे के लिए कामास ब्रिलियंट ब्लू के साथ रंगा गया, और जब तक पृष्ठभूमि का नीला रंग हल्का नहीं हो गया और स्पष्ट प्रोटीन बैंड दिखाई नहीं देने लगे;

15、बाद के ऑपरेशन के परिणामों के अनुसार, प्रत्येक नमूने के प्रोटीन बैंड का विश्लेषण करें: यदि हेटरोज्यगस बैंड या हेटरोज्यगस बैंड या कम और उथले के बिना प्रोटीन में उत्सर्जित प्रोटीन नमूने, डायलिसिस और एकाग्रता हो सकते हैं, यदि अधिक हेटरोज्यगस बैंड को डायलिसिस और एकाग्रता के बाद फिर से शुद्ध करने की आवश्यकता होती है।

16、डायलिसिस: डायलिसिस झिल्ली में नमूना जोड़ें, दोनों सिरों को क्लैंप करें, रात भर 4℃ पर डायलिसिस;

17、एकाग्रता: नमूने के आणविक भार आकार के अनुसार उचित एकाग्रता ट्यूब 4 ℃ कम गति एकाग्रता, प्रोटीन एकाग्रता माप की एकाग्रता, लेबलिंग, तरल नाइट्रोजन में त्वरित-ठंड का चयन करने के लिए, और फिर -80 ℃ रेफ्रिजरेटर में जमे हुए।

नीचे दिया गया आंकड़ा इन विट्रो में जीएफपी प्रोटीन आत्मीयता शुद्धि का कोफेक्शन प्लॉट दिखाता है, और शुद्ध प्रोटीन की शुद्धता और एकाग्रता में काफी वृद्धि हुई है