प्रोटीन शुद्धि    आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीकों के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं में प्रोटीन के लिए न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम कोडिंग शुरू करने की प्रक्रिया है, जिससे उन्हें बड़ी मात्रा में व्यक्त किया जा सकता है, और फिर उच्च शुद्धता, गतिविधि और उपज के प्रोटीन प्राप्त करने के लिए उपयुक्त शुद्धि विधियों का उपयोग करके इन विट्रो में उन्हें शुद्ध करना । प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों को प्रोकैरियोटिक सिस्टम और यूकेरियोटिक सिस्टम में वर्गीकृत किया जा सकता है.

के सिद्धांतों और तरीके प्रोकैरियोटिक सिस्टम में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने और आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके इन विट्रो में प्रोटीन को शुद्ध करने नीचे वर्णित हैं।

1 ose लैक्टोज मैनिपुलेटर का नकारात्मक विनियमन:

लैक्टोज की अनुपस्थिति में, एलएसी मैनिपुलेटर डिटेरेंस की स्थिति में होता है, जिस समय आई सीक्वेंस एलएसी डिटरेन्ट प्रोटीन को ओ अनुक्रम से बांधने के लिए व्यक्त करता है, आरएनए पोलीमरेज़ को पी अनुक्रम से बाध्यकारी से रोकता है और ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा को रोकता है। जब लैक्टोज मौजूद होता है, तो लैक्टोज सेल में प्रवेश करता है और id-galactosidase द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है और इसे अलग-अलग करने के लिए परिवर्तित किया जाता है, जो निरोधात्मक प्रोटीन को बांधता है, जिससे प्रोटीन में एक परिवर्तन होता है और ओ अनुक्रम से निरोधात्मक प्रोटीन के विघटन के लिए अग्रणी होता है, जिससे ट्रांसक्रिप्शन शुरू होता है।

Isopropylthiogalactoside (IPTG) उसी तरह से कार्य करता है जैसे कि isogalactose और एक अत्यंत शक्तिशाली inducer है जो बैक्टीरिया द्वारा मेटाबोलाइज़ नहीं किया जाता है और बहुत स्थिर होता है, और इसलिए इसे प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

2 、 मेजबान तनाव चयन:

(1) बीएल 21 प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले उपभेदों में से एक है, जो मुख्य रूप से ई। कोलाई पोलीमरेज़ के साथ गैर-विषैले प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है , इसलिए इसे टीएसी या टीआरसी (ईजी पीजीएक्स, पीएमएएलएलएलएलएलएस) जैसे ई कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके प्रोकैरियोटिक सिस्टम की अभिव्यक्ति पर लागू किया जा सकता है।

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3, प्रोटीन शुद्धि विधियाँ:

। ​अणुओं से बाहर निकले बाद में बाद में क्षीणता से छोटे होते हैं।

(2) आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी: प्रोटीन पृथक्करण और शोधन प्रोटीन की सतह पर अलग -अलग आरोपों पर आधारित है, प्रोटीन की सतह को आमतौर पर समान रूप से चार्ज किया जाता है, और कुछ शर्तों के तहत cation/आयन एक्सचेंज कॉलम के साथ जोड़ा जा सकता है। जब पीएच को बदल दिया जाता है या धीरे -धीरे बढ़ती आयनिक शक्ति के साथ एक बफर का उपयोग क्षालन के लिए किया जाता है, तो बाध्य पदार्थ का आदान -प्रदान किया जा सकता है जो आयनों के साथ एलुएंट में और समाधान में eluted हो सकता है। चूंकि अलग -अलग पदार्थों में अलग -अलग शुल्क होते हैं और आयन एक्सचेंज कॉलम के साथ अलग -अलग बाइंडिंग क्षमताएं होती हैं, इसलिए समाधान में eluted होने का क्रम भी अलग है।

। ​ उच्चे से नीचा।

(4) आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी: एक प्रोटीन के विशिष्ट लिगैंड को शुद्ध किया जाना (या प्रोटीन पर टैग किया गया) सहसंयोजक रूप से उचित रासायनिक तरीकों से वाहक अणु से जुड़ा हुआ है। जब प्रोटीन मिश्रण को आत्मीयता माध्यम से भरे क्रोमैटोग्राफिक कॉलम में जोड़ा जाता है, तो शुद्ध किया जाने वाला प्रोटीन विशेष रूप से लिगैंड से बंधा होता है, जबकि अन्य प्रोटीन धोने से बाध्य और हटाए जाते हैं, और विशेष रूप से बाध्य प्रोटीन को मुक्त संगत लिगैंड के समाधान के साथ बंद किया जा सकता है। विशेष रूप से बाध्य प्रोटीन को एक समाधान के साथ मुक्त किया जा सकता है जिसमें मुक्त संबंधित लिगैंड होता है।

4 、 प्रोटीन शुद्धि लेबल का चयन:

विभिन्न लेबल की विशेषताएं इस प्रकार हैं ↓

HIS-TAG शुद्धिकरण: उनका टैग सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले टैग में से एक है, जहां 6-10 हिस्टिडीन को प्रोटीन के अमीनो या कार्बोक्सिल टर्मिनस में जोड़ा जाता है, और लक्ष्य प्रोटीन को सामान्य या विकृति की स्थिति (जैसे, 8m यूरिया) के साथ NI2+ chelating स्तंभों को कसकर बांधने की क्षमता से शुद्ध किया जाता है, और फिर imidazole (जो कि इमिडाज के साथ eluted)

प्रयोगशाला अभिकर्मक:

Iptg; एलबी माध्यम;

Lysis बफर: 20 मिमी Tris (7.9), 500 मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole;

वॉश बफर: 20 मिमी ट्रिस (7.9), 500 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole;

एल्यूशन बफर: 20 मिमी ट्रिस (7.9), 200 मिमी NaCl, 300 मिमी इमिडाज़ोल ( इमिडाज़ोल एकाग्रता को क्षालन दक्षता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है );

डायलिसिस समाधान: 20 मिमी ट्रिस (7.9), 50 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल;

Kaomas शानदार नीला धुंधला समाधान; विघटित समाधान

उपकरण:

नी-एनटीए, अल्ट्रासोनिक ब्रेकर, क्रोमैटोग्राफी कॉलम, एकाग्रता ट्यूब

1 oct प्रोकैरियोटिक एक्सप्रेशन प्लास्मिड का निर्माण: लक्ष्य जीन का पीसीआर, वेक्टर पाचन, बंधाव, परिवर्तन, अनुक्रमण के लिए एकल क्लोन चुनना;

2 、 सफलतापूर्वक निर्मित प्लास्मिड को BL21 (DE3) में बदल दें, 37 ℃ पर रात भर ऊष्मायन करें, और रात भर छोटे झटकों के लिए सिंगल क्लोन चुनें;

3 、 सबसे अच्छी इंडक्शन स्थितियों का पता लगाने के लिए छोटा इंडक्शन: रात भर में बैक्टीरियल सॉल्यूशन 1: 1000 इनोक्यूलेशन को 3ml lb में हिलाया जाएगा, 37 of rection rection rective 4-5h को बैक्टीरियल सॉल्यूशन OD600 = 0.6-0.8 में, IPTG की अलग-अलग सांद्रता जोड़ें (0.1-1MM), अलग-अलग तापमान, induction, inductid 6H-8H, 16 ℃ प्रेरित 16-20H, 16 ° C प्रेरित 16-20H, तापमान कम हो जाता है, समय बढ़ाया जाता है, जैसे कि 37 ℃ प्रेरित 4-5H, 30 ℃ प्रेरित 6H-8H, 16 ° C प्रेरित 16-20H, तापमान कम हो जाता है। C 16-20H के लिए, विभिन्न प्रेरण परिस्थितियों में प्रेरण से पहले और बाद में बैक्टीरिया SAP लें, जेल को चलाएं, दाग और इंडक्शन के परिणामों का निरीक्षण करें; (आम तौर पर, आईपीटीजी की एकाग्रता कम और इंडक्शन तापमान को कम करते हैं, लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति को धीमा करते हैं, प्रोटीन के सही तह के लिए अधिक अनुकूल, जिससे उनकी घुलनशीलता बढ़ जाती है और समावेश निकायों की पीढ़ी को कम किया जाता है)

4 、 सबसे उपयुक्त इंडक्शन स्थितियों को खोजने के बाद, बैक्टीरियल घोल 1: 1000 को एलबी के 2 एल में टीका लगाएं, बैक्टीरिया के समाधान के OD600 तक 37 ℃ पर हिलाएं = 0.6-0.8, बैक्टीरियल सॉल्यूशन के 20μl को छोड़ दें और इसे जेल (1) को छोड़ दें, फिर प्री-एक्सपेरिमेंट को छोड़ दें, और जेल (2);

5 、 प्रेरित बैक्टीरियल तरल को हटा दें, 4000g पर 4000g पर सेंट्रीफ्यूज 4 ℃ पर;

6 、 सुपरनैटेंट को त्यागें, वजन करें, प्रत्येक ग्राम बैक्टीरिया के लिए 10ml lysis बफर (1: 100 प्लस प्रोटीज इनहिबिटर) जोड़ें, लगभग 30min के लिए बर्फ पर रखें;

7, प्रेशर क्रशिंग: उच्च दबाव वाले होमोजेनाइज़र में अल्कोहल को बंद करें, दो बार पानी के साथ कुल्ला, एक बार संतुलित करने के लिए लसीका बफर का उपयोग करें, बैक्टीरियल तरल जोड़ें, दबाव (दबाव 800kpa से अधिक नहीं होना चाहिए), बैक्टीरियल तरल तीन से पांच बार पारदर्शी और चिपचिपा नहीं है;

8 、 कुचल बैक्टीरियल तरल, 12000G, 4 of सेंट्रीफ्यूजेशन को 20min के लिए, सतह पर तैरनेवाला और अवक्षेपण पृथक्करण एकत्र करें, प्रत्येक ने 20μL नमूना (3) (4) को चलाया जाए ताकि जेल चलाया जा सके;

92ml ni-nta को शुद्धिकरण कॉलम में जोड़ा गया था, इथेनॉल को फ़िल्टर किया गया था, पानी के साथ rinsed, और स्तंभ को संतुलित करने के लिए lysis बफर को जोड़ा गया;

10 、 lysis बफर के साथ ni-nta resuspension जो कि सतह पर तैरनेवाला में जोड़ा गया, अच्छी तरह से मिलाएं, 2h के लिए 4 ℃ शेकर ऊष्मायन;

11 、 सुपरनैटेंट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ के माध्यम से पारित किया गया था, और फिल्ट्रेट के 20 μl को एकत्र किया गया था (5);

12 、 5ml वॉश बफर के साथ कॉलम को 3 बार धो लें, फिल्ट्रेट नमूना 20μL (6) एकत्र करें;

13 、 1ml elution बफर जोड़ें, 5min के लिए इनक्यूबेट करें, eluate को इकट्ठा करें, 5 बार दोहराएं, एक ही ट्यूब में 5ml का Eluate इकट्ठा करें, नमूना के 20μl छोड़ दें (7);

14 、 प्रयोग के दौरान प्राप्त व्यक्तिगत प्रोटीन के नमूने चलाए गए, 1h के लिए Caumas शानदार नीले रंग के साथ दागे गए, और जब तक पृष्ठभूमि नीला रंग हल्का नहीं था, तब तक विघटित हो गया था और स्पष्ट प्रोटीन बैंड दिखाई देते थे;

15 、 प्रत्येक नमूने के प्रोटीन बैंड का विश्लेषण करें, बाद के ऑपरेशन के परिणामों के अनुसार: यदि हेटेरोज़ीगस बैंड या हेटेरोज़ीगस बैंड या कम और उथले के बिना प्रोटीन में eluted प्रोटीन के नमूने, डायलिसिस और एकाग्रता हो सकते हैं, यदि डायवियिसिस और एकाग्रता के बाद फिर से शुद्ध होने की आवश्यकता है।

16 、 डायलिसिस: डायलिसिस झिल्ली में नमूना जोड़ें, दोनों छोरों को क्लैंप करें, रात में 4 पर डायलिसिस;

17 、 एकाग्रता: उपयुक्त एकाग्रता ट्यूब 4 of कम-गति एकाग्रता, प्रोटीन एकाग्रता माप की एकाग्रता, लेबलिंग, तरल नाइट्रोजन त्वरित-फ्रीजिंग में, और फिर -80 ℃ रेफ्रिजरेटर में जमे हुए नमूने के आणविक भार आकार के अनुसार।

नीचे दिया गया आंकड़ा इन विट्रो में GFP प्रोटीन आत्मीयता शुद्धि का एक kofection प्लॉट दिखाता है, और शुद्धता और शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता बहुत बढ़ जाती है