Oczyszczanie białka    jest procesem wprowadzania sekwencji kwasu nukleinowego kodujące białka do komórek gospodarza za pomocą technik inżynierii genetycznej, powodując, że są wyrażane w dużych ilościach, a następnie oczyszczanie ich in vitro przy użyciu odpowiednich metod oczyszczania w celu uzyskania białek o wysokiej czystości, aktywności i wydajności . Systemy ekspresji białek można podzielić na układy prokariotyczne i układy eukariotyczne.

Zasady i metody indukowania ekspresji białka w układach prokariotycznych i oczyszczania białek in vitro przy użyciu chromatografii powinowactwa opisano poniżej.

1 、 Negatywna regulacja manipulatora laktozy:

W przypadku braku laktozy manipulator LAC jest w stanie odstraszania, w którym to czasie sekwencja I wyraża białko odstraszające LAC, aby wiązać się z sekwencją O, zapobiegając wiązaniu polimerazy RNA z sekwencją P i hamując inicjowanie transkrypcji. Gdy laktoza jest obecna, laktoza wchodzi do komórki i jest katalizowana przez β-galaktozydazę i przekształcana w izolaktozę, która wiąże się z białkiem hamującym, powodując zmianę konformacyjną białka i prowadzi do dysocjacji białka hamującego od sekwencji O, a tym samym rozpoczęcie transkrypcji.

Izopropylotiogalaktozyd (IPTG) działa w taki sam sposób jak izogalaktoza i jest niezwykle silnym induktorem, który nie jest metabolizowany przez bakterie i jest bardzo stabilny, a zatem jest szeroko stosowany w laboratoriach.

2 、 Wybór odkształcenia gospodarza:

(1) BL21 jest jednym z najczęściej stosowanych szczepów do ekspresji prokariotycznej, która jest głównie odpowiednia do ekspresji nietoksycznych białek z polimerazą E. coli, dzięki czemu można je zastosować do ekspresji układów prokariotycznych przy użyciu polimerazy RNA E. coli, takich jak TAC lub TRC (np. PGEX, plazmidy PMAL).

(2) BL21 (DE3) integruje gen polimerazy RNA fagu T7 w regionie λ faga DE3 na chromosomie szczepu BL21, który może wyrażać zarówno polimerazę RNA RNA, jak i polimerazę RNA E. coli i może być stosowana do ekspresji plazmidów, takich jak seria PET, PGEX, PMAL i tak dalej.

3, Metody oczyszczania białka:

(1) Chromatografia filtracji żelowej: zgodnie z wielkością molekularną od mieszaniny do oddzielnych białek, kształt różnych białek i wielkość cząsteczkową różnic w mieszaninie poprzez kolumnę chromatografii filtracyjnej żelowej do odmiennej cząsteczki zdolności do odmienności, większe białka, będzie to pierwsze. Wyelfowane z cząsteczek są mniejsze, później, później elucja.

(2) Chromatografia wymiany jonów: Rozdział i oczyszczanie białka opiera się na różnych ładunkach na powierzchni białka, powierzchnia białka jest zwykle równomiernie naładowana i można je łączyć z kolumnami kationowymi/anionowymi w określonych warunkach. Gdy do elucji stosuje się bufor o stopniowo rosnącej wytrzymałości jonowej, wiązaną substancję można wymieniać z jonami w eluent i elurować w roztworze. Ponieważ różne substancje mają różne ładunki i różne zdolności wiązania z kolumną wymiany jonów, kolejność elucji w rozwiązaniu jest również różna.

(3) Chromatografia hydrofobowa: Stosując hydrofobowość białek, reszty hydrofobowe zostaną odsłonięte na powierzchni białek po denaturacji lub w środowisku o wysokiej soli, hydrofobowe reszty różnych białek mają różne wytrzymałość działań z ligandami hydrofobowymi ligandów stacjonarnej fazy stacjonarnej, a hydrofobowość może być wykorzystana jako najsłabsza do silnej separacji. Niski.

(4) Chromatografia powinowactwa: specyficzny ligand białka, który ma być oczyszczony (lub oznaczony na białku) jest kowalencyjnie przyłączany do cząsteczki nośnej odpowiednimi metodami chemicznymi. Gdy mieszaninę białka jest dodawana do kolumny chromatograficznej wypełnionej pożywką powinowactwa, białko do oczyszczania jest szczególnie związane z ligandem, podczas gdy inne białka nie są związane i usuwane przez mycie, a konkretnie związane białko można elurować roztworem wolnego ligandu. Specyficznie związane białka można elurować za pomocą roztworu zawierającego wolny odpowiadający ligand.

4 、 Wybór etykiet oczyszczania białka:

Charakterystyka różnych etykiet jest następująca

Oczyszczanie His-Tag: His-Tag jest jednym z najczęściej używanych znaczników, w których 6-10 histydyna jest dodawana do terminu aminowego lub karboksylowego białka, a białko docelowe jest oczyszczane przez jego zdolność do ścisłego wiązania się z kolumnami chelatującymi Ni2+ w warunkach normalnych lub odznaczających (EG, 8m moczowych), a następnie zaprojektowanego z imidazolem (który rywalizuje z jamami NickEds w płaszczyźnie.

Odczynniki laboratoryjne:

Iptg; Medium LB;

Bufor do lizy: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 10 mM imidazol;

Bufor do prania: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 20 mM imidazol;

Bufor elucji: 20 mm Tris (7,9), 200 mm NaCl, imidazol 300 mm ( stężenie imidazolu można regulować zgodnie z wydajnością elucji );

Roztwór dializy: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10% glicerolu;

Kaomas genialny błękitne rozwiązanie barwienia; Rozwiązanie odbarwiające

Instrumenty:

NI-NTA, wyłącznik ultradźwiękowy, kolumna chromatograficzna, rurki stężeniowe

1 、 Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego prokariotycznego: PCR genu docelowego, trawienie wektorowe, podwiązanie, transformacja, zbieranie pojedynczego klonu do sekwencjonowania;

2 、 Przekształć pomyślnie skonstruowany plazmid w BL21 (DE3), inkubuj przy 37 ℃ przez noc i wybierz pojedynczy klon do małego wstrząsania przez noc;

3 、 Mała indukcja W celu znalezienia najlepszych warunków indukcyjnych: Zostanie wstrząśnięte przez noc roztworu bakteryjnego 1: 1000 w 3 ml funta, 37 ℃ wstrząsanie 4-5H do roztworu bakteryjnego OD600 = 0,6-0,8, dodaj różne stężenia IPTG (0,1-1 mm), różne temperatury, z różnymi temperaturami, z różnymi temperaturami, różnymi temperaturami, różnymi temperaturami, różnymi temperaturami, różnymi temperaturami. indukowane 6H-8H, 16 ℃ indukowane 16-20H, 16 ° C indukowane 16-20H, temperatura jest zmniejszona, czas jest wydłużony, na przykład indukowany 37 ℃ 4-5H, 30 ℃ indukowany 6H-8H, 16 ° C, temperatura jest obniżona. C W 16-20H weź bakteryjne sok przed i po indukcji w różnych warunkach indukcyjnych, uruchom żel, plam i obserwuj wyniki indukcji; (Ogólnie rzecz biorąc, im niższe stężenie IPTG i niższa temperatura indukcyjna, im wolniejsza ekspresja białka docelowego, tym bardziej sprzyjają prawidłowym fałdowaniu białek, zwiększając w ten sposób ich rozpuszczalność i zmniejszając wytwarzanie ciał inkluzyjnych)

4 、 Po znalezieniu najbardziej odpowiednich warunków indukcyjnych zaszczepienie roztworu bakteryjnego 1: 1000 do 2L LB, wstrząśnij 37 ℃, aż do OD600 roztworu bakteryjnego = 0,6-0,8, aspiruj 20 μl roztworu bakteryjnego i pozostaw go do uruchomienia żelowego (1), a następnie zaprzestał wyrażenia białka w warunkach indukcji w stosunku do indukcji w stosownych warunkach, a podsumowanie 20 μl roztworu bachowego roztworu Bachle. i zostaw to, aby uruchomić żel (2);

5 、 Usuń indukowaną ciecz bakteryjną, wirówkę przy 4000 g przez 15 minut przy 4 ℃;

6 、 Odrzuć supernatant, zważyć, dodaj 10 ml buforu do lizy (1: 100 plus inhibitor proteazy) dla każdego grama bakterii, ponownie, umieść na lodzie przez około 30 minut;

7 、 Zmiażdżenie ciśnieniowe: Odłóż alkohol w homogenizatorze wysokociśnieniowym, dwa razy spłucz wodą, użyj buforu do lizy, aby raz zrównoważyć, dodaj ciecz bakteryjną, ciśnienie (ciśnienie nie powinno przekraczać 800 kPa), ciecz bakteryjna w stosunku do trzech do pięciu razy do przezroczystego i nie lepkiego;

8 、 Zbieraj zmiażdżoną ciecz bakteryjną, wirowanie 12000 g, 4 ℃ dla 20 minut, supernatantu i oddzielenia osadu, każda zachowała 20 μl próbki (3) (4), aby być uruchamiającym żel;

9、2 ml Ni-NTA dodano do kolumny oczyszczania, do filtrowania etanolu, przepłukania wody i dodania buforu do lizy w celu zrównoważonego kolumny;

10 、 Z Buforem Lyszy NI-NTA Revespension dodane do supernatantu, dobrze wymieszaj, 4 ℃ inkubacja shakera przez 2 godziny;

11 、 Supernatant przepuszczono przez kolumnę w 4 ° C i zebrano 20 μl filtratu (5);

12 、 Umyj kolumnę 5 ml buforem prania 3 razy, zbierz próbkę filtratu 20 μl (6);

13 、 Dodaj 1 ml bufor elucji, inkubuj dla 5 minut, zbierz eluat, powtórz 5 razy, zbierz 5 ml eluatu w tej samej rurce, pozostaw 20 μl próbki (7);

14 、 Poszczególne próbki białek uzyskane w trakcie eksperymentu, zabarwione genialnym błękitem CAUMAS przez 1h i odchwycone, aż kolor niebieski w tle był lżejszy i widoczne były przejrzyste pasma białkowe;

15 、 Przeanalizuj pasma białka każdej próbki, zgodnie z wynikami późniejszej operacji: jeśli eluowane próbki białka w białku bez heterozygotycznych pasm lub heterozygotycznych pasm lub mniejszych i płytkich, może być dializatem i stężeniem, jeśli bardziej heterozygotyczne pasma wymagają ponownego oczyszczania po dializie i stężeniu.

16 、 Dializa: Dodaj próbkę do membrany dializy, zaciska oba końce, dializa przy 4 ℃ przez noc;

17 、 Stężenie: Według wielkości masy cząsteczkowej próbki w celu wybrania odpowiedniej rurki stężenia 4 ℃ Niski stężenie, stężenie pomiaru stężenia białka, znakowanie, w ciekłym azocie szybkie zamrażanie, a następnie zamrożone w lodówce -80 ℃.

Poniższa rysunek pokazuje wykres kofekcji oczyszczania powinowactwa białka GFP in vitro, a czystość i stężenie oczyszczonego białka jest znacznie zwiększone