A fehérjetisztítás    az a folyamat, amelynek során a fehérjéket kódoló nukleinsavszekvenciákat géntechnológiai technikákkal juttatják be a gazdasejtekbe, nagy mennyiségben expresszálják őket, majd megfelelő tisztítási módszerekkel in vitro tisztítják őket, hogy nagy tisztaságú, aktivitású és hozamú fehérjéket kapjanak . A fehérje expressziós rendszerek oszthatók prokarióta rendszerekre és eukarióta rendszerekre .

a fehérjeexpresszió indukálására a prokarióta rendszerekben és a fehérjék in vitro tisztítására vonatkozó elveket és módszereket affinitáskromatográfiával . Az alábbiakban ismertetjük

1, A laktóz manipulátor negatív szabályozása:

Laktóz hiányában a lac manipulátor elrettentő állapotban van, ekkor az I szekvencia a Lac elrettentő fehérjét expresszálja, hogy az O szekvenciához kötődjön, ami megakadályozza az RNS polimeráz kötődését a P szekvenciához és gátolja a transzkripció beindulását. Ha laktóz van jelen, a laktóz belép a sejtbe, és a β-galaktozidáz katalizálja, és izolaktózzá alakul, amely a gátló fehérjéhez kötődik, ami konformációs változást okoz a fehérjében, és a gátló fehérje disszociációjához vezet az O szekvenciától, ezáltal megindítja a transzkripciót.

Az izopropil-tiogalaktozid (IPTG) ugyanúgy működik, mint az izogalaktóz, és rendkívül erős induktor, amelyet a baktériumok nem metabolizálnak, és nagyon stabil, ezért széles körben használják a laboratóriumokban.

2, gazdatörzs kiválasztása:

(1) A BL21 az egyik leggyakrabban használt törzs a prokarióta expresszióra, amely elsősorban nem toxikus fehérjék E. coli polimerázzal történő expresszálására alkalmas, így prokarióta rendszerek expressziójára is alkalmazható E. coli RNS polimeráz, például tac vagy trc (pl. pGEX, pMAL plazmidok) segítségével.

(2) A BL21(DE3) integrálja a T7 fág RNS polimeráz gént a BL21 törzs kromoszómájának λ fág DE3 régiójába, amely képes mind a T7 RNS polimerázt, mind az E. coli RNS polimerázt expresszálni , és felhasználható olyan plazmidok expressziójára, mint a pET sorozat, pGEX, stb., pMAL.

3, fehérje tisztítási módszerek:

(1) Gélszűrős kromatográfia: a keverékből a különálló fehérjékig terjedő molekulaméret, a különböző fehérjék alakja és a töltőanyag-részecskéket tartalmazó gélszűrős kromatográfiás oszlopon keresztül a keverék molekulamérete szerint, a különböző fehérjék molekulamérete miatt eltérő, a diffúzió az apertúra fajlagos méretébe történik, a nagyobb lesz az eluálhatóság a fehérje részecskéihez A molekulák közül minél kisebbek, annál későbbi az elúció.

(2) Ioncserélő kromatográfia: a fehérje elválasztás és tisztítás a fehérje felületén lévő különböző töltéseken alapul, a fehérje felülete általában egyenletes töltésű, és bizonyos körülmények között kation/anioncserélő oszlopokkal kombinálható. Ha a pH-t változtatjuk, vagy fokozatosan növekvő ionerősségű puffert használunk az elúcióhoz, a megkötött anyag kicserélhető az eluensben lévő ionokkal és eluálható az oldatba. Mivel a különböző anyagok töltése és kötőképessége eltérő az ioncserélő oszloppal, az oldatba eluálás sorrendje is eltérő.

(3) Hidrofób kromatográfia: A fehérjék hidrofób hatását alkalmazva a hidrofób maradékok a fehérjék felületén denaturálás után vagy magas sótartalmú környezetben kerülnek ki, a különböző fehérjék hidrofób maradékai eltérő hatáserősséggel rendelkeznek az állófázis hidrofób ligandumaival, és a hidrofób elválasztás a legerősebb komponens eluálása révén használható fel ionos erősségként. sorrendben magasról alacsonyra.

(4) Affinitáskromatográfia: a tisztítandó (vagy a fehérjén megjelölendő) fehérje specifikus ligandumát megfelelő kémiai módszerekkel kovalensen kötik a hordozómolekulához. Ha a fehérjekeveréket az affinitásközeggel töltött kromatográfiás oszlopra adjuk, a tisztítandó fehérje specifikusan kötődik a ligandumhoz, míg a többi fehérje nem kötődik és mosással távolítható el, a specifikusan megkötött fehérje pedig a megfelelő szabad ligandum oldatával eluálható. A specifikusan kötött fehérjék a megfelelő szabad ligandumot tartalmazó oldattal eluálhatók.

4. A fehérjetisztító címkék kiválasztása:

A különböző címkék jellemzői a következők↓

His-tag tisztítás: A His-tag az egyik leggyakrabban használt jelölés, ahol 6-10 hisztidint adnak a fehérje amino- vagy karboxil-terminálisához, és a célfehérjét azáltal tisztítják meg, hogy normál vagy denaturáló körülmények között (pl. 8M karbamid) szorosan kötődik Ni2+ kelátképző oszlopokhoz, majd eluálják az imidazolionok kötődését. kutak).

Laboratóriumi reagensek:

IPTG; LB táptalaj;

Lizispuffer: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 10 mM imidazol;

Mosópuffer: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 20 mM imidazol;

Elúciós puffer: 20 mM Tris (7,9), 200 mM NaCl, 300 mM imidazol ( az imidazol koncentrációja az elúció hatékonyságának megfelelően állítható );

Dialízisoldat: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10% glicerin;

Kaomas Brilliant Blue festőoldat; színtelenítő oldat

Hangszerek:

Ni-NTA, ultrahangos megszakító, kromatográfiás oszlop, koncentráló csövek

1. Prokarióta expressziós plazmid megalkotása: a célgén PCR-je, vektoremésztés, ligálás, transzformáció, egyetlen klón kiválasztása a szekvenáláshoz;

2. A sikeresen megszerkesztett plazmidot BL21(DE3)-ba alakítjuk, éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, majd az egyetlen klónt egy éjszakán át kismértékben rázzuk;

3、Kis indukció a legjobb indukciós körülmények kiderítésére: egy éjszakán át rázzuk baktériumoldat 1:1000 oltás 3 ml LB-be, 37 ℃ rázás 4-5 óra a bakteriális oldathoz OD600 = 0,6-0,8, adjunk hozzá különböző koncentrációjú IPTG-t, különböző hőmérsékletű indukciós idő, alacsonyabb hőmérséklet (0,1-1 m) meghosszabbított, például 37 ℃ indukált 4-5h, 30 ℃ indukált 6h-8h, 16 ℃ indukált 16-20h, 16 °C indukált 16-20h, a hőmérséklet csökken, az idő meghosszabbodik, például 37 ℃ indukált,-30 ℃ indukált 6h,-30-5h 16 ° C-on indukált 16-20 óra, a hőmérséklet csökken. C 16-20 órán át, vegye ki a baktériumlevet az indukció előtt és után különböző indukciós körülmények között, futtassa le a gélt, festse meg és figyelje meg az indukció eredményét; (Általánosságban elmondható, hogy minél alacsonyabb az IPTG koncentrációja és minél alacsonyabb az indukciós hőmérséklet, annál lassabb a célfehérje expressziója, annál jobban elősegíti a fehérjék megfelelő feltekeredését, ezáltal növeli azok oldhatóságát és csökkenti a zárványtestek képződését)

4. Miután megtalálta a legmegfelelőbb indukciós körülményeket, oltsa be a bakteriális oldatot 1:1000 arányban 2 l LB-be, rázza 37 °C-on, amíg a baktériumoldat OD600 értéke 0,6-0,8, szívjon fel 20 μL bakteriális oldatot, és hagyja, hogy a kapott gél indukálja az expressziót megfelelő körülmények között (1), majd a kapott fehérje indukálására. végezzen előkísérletet, szívjon fel 20 μL bakteriális oldatot, és hagyja futni a gélt (2);

5. Távolítsa el az indukált bakteriális folyadékot, centrifugálja 4000 g-vel 15 percig 4 °C-on;

6. Dobja el a felülúszót, mérje le, adjon hozzá 10 ml lízispuffert (1:100 plusz proteáz inhibitor) minden gramm baktériumhoz, szuszpendálja újra, helyezze jégre körülbelül 30 percre;

7. Nyomás alatti zúzás: távolítsa el az alkoholt a nagynyomású homogenizátorban, öblítse le kétszer vízzel, egyszer használjon lízispuffert az egyensúlyhoz, adja hozzá a bakteriális folyadékot, nyomás alá helyezi (a nyomás nem haladhatja meg a 800 kpa-t), a bakteriális folyadékot háromszor-ötször átlátszóra és nem ragadósra;

8. Gyűjtse össze a zúzott bakteriális folyadékot, 12000 g, 4 °C-os centrifugálás 20 percig, a felülúszó és a csapadék elválasztása, mindegyik visszatartott 20 μl minta (3) (4), hogy gélt futtasson;

9,2 ml Ni-NTA-t adunk a tisztító oszlophoz, etanollal szűrjük, vízzel öblítjük, és lízispuffert adunk hozzá, hogy egyensúlyba hozzuk az oszlopot;

10、Lysis puffer Ni-NTA reszuszpenzióval a felülúszóhoz, jól keverjük össze, 4 ℃ rázógépben inkubáljuk 2 órán át;

11. A felülúszót 4 °C-on átengedtük az oszlopon, és 20 μl szűrletet gyűjtöttünk össze (5);

12、Mossuk ki az oszlopot 5 ml mosópufferrel háromszor, gyűjtsük össze a szűrletmintát 20 µl-rel (6);

13、Adjunk hozzá 1 ml eluátum puffert, inkubáljuk 5 percig, gyűjtsük össze az eluátumot, ismételjük meg 5-ször, gyűjtsünk 5 ml eluátumot ugyanabba a csőbe, hagyjunk 20 µl mintát (7);

14. A kísérlet során kapott egyedi fehérjemintákat lefuttattuk, 1 órán át Caumas Brilliant Blue-val festettük, és addig színtelenítettük, amíg a háttérkék színe világosabb lett, és tiszta fehérjecsíkok nem látszottak;

15、Elemezzük az egyes minták fehérjesávjait, a következő művelet eredményei szerint: ha a fehérjében heterozigóta sávok vagy heterozigóta sávok nélküli, vagy kevesebb és sekély eluált fehérjeminták lehetnek dialízis és koncentrálás, ha több heterozigóta sávot kell újra tisztítani dialízis és koncentrálás után.

16、Dialízis: helyezze a mintát a dialízis membránba, rögzítse mindkét végét, dialízis 4°C-on egy éjszakán át;

17、Koncentráció: a minta molekulatömegének megfelelően a megfelelő koncentrációs cső kiválasztásához 4 ℃ alacsony sebességű koncentráció, fehérjekoncentráció koncentráció mérés, címkézés, folyékony nitrogénben történő gyorsfagyasztás, majd -80 ℃ hűtőszekrényben fagyasztva.

Az alábbi ábra a GFP fehérje affinitás-tisztításának in vitro kofekciós görbéjét mutatja, és a tisztított fehérje tisztasága és koncentrációja jelentősen megnő.