A fehérje tisztítása    a nukleinsav -szekvenciák bevezetésének folyamata, amelyek a fehérjéket a gazdasejtekbe géntechnikai technikák révén kódolják, és nagy mennyiségben expresszálják őket, majd megfelelő tisztítási módszerekkel tisztítják őket, hogy magas tisztaságú, aktivitású és hozamú fehérjéket kapjanak . A fehérje expressziós rendszereket lehet besorolni prokarióta rendszerekbe és eukarióta rendszerekbe .

a fehérje expresszió indukálásának alapelveit és módszereit az affinitáskromatográfia A prokarióta rendszerekben alkalmazásával in vitro tisztítófehérjékben az alábbiakban ismertetjük.

1 、 A laktóz -manipulátor negatív szabályozása:

Lactose hiányában a LAC manipulátor elrettentési állapotban van, amikor az I szekvencia kifejezi a LAC elrettentő fehérjét, hogy kötődik az O -szekvenciához, megakadályozva, hogy az RNS -polimeráz a P szekvenciához kötődjön és gátolja a transzkripció iniciációját. Ha laktóz van jelen, a laktóz belép a sejtbe, és β-galaktozidázzal katalizálja, és izolaktózsá alakul, amely kötődik a gátló fehérjéhez, konformációs változást okozva a gátló fehérje disszociációjához az O szekvenciától, ezáltal átírva.

Az izopropil -tiogalaktozid (IPTG) ugyanúgy működik, mint az izogalaktóz, és egy rendkívül erős induktor, amelyet a baktériumok nem metabolizálnak, és ezért nagyon stabil, és ezért széles körben használják a laboratóriumokban.

2 、 A gazdaszervezet törzsválasztéka:

(1) A BL21 a prokarióta expresszió egyik leggyakrabban használt törzse, amely elsősorban a nem mérgező fehérjék E. coli polimerázzal történő expressziójára alkalmas, így alkalmazható a prokarióta rendszerek expressziójára E. coli rNS polimeráz, például TAC vagy TRC felhasználásával (pl. PGEX, PMAL plazmidok).

(2) A BL21 (DE3) integrálja a T7 fág -RNS polimeráz gént az λ fág DE3 régiójában a BL21 törzs kromoszómáján, amely képes mind a T7 RNS polimerázt, mind az E. coli RNS -polimerázt kifejezni , és felhasználható a plazmidok expressziójára, mint például a PET sorozat, a PGEX, a PMAL és az SO.

3, Fehérje tisztítási módszerek:

(1) Gel szűrési kromatográfia: A keverékből származó molekuláris méret szerint a különféle fehérjék alakja és a keverék különbségeinek molekuláris mérete a gélszűrő kromatográfiás oszlopon keresztül, a különféle fehérjék molekuláris mérete miatt, a nagyobb fehérjék molekulájának megsemmisítése, a nagyobb fehérjékek, a nagyobb fehérjék -molekulák, a diffúzió a diffúziónak az első méretű részei, a nagyobb fehérjék -molekulák, a diffúzió az elsődleges méretűek. A molekulákból eluálva kisebbek, minél később, minél később az elúció.

(2) Ioncserélő kromatográfia: A fehérje elválasztása és tisztítása a fehérje felületén lévő különféle töltéseken alapul, a fehérje felülete általában egyenletesen tölthető be, és bizonyos körülmények között kombinálható/anioncserélő oszlopokkal kombinálható. Ha a pH -t megváltozik, vagy az elúcióhoz fokozatosan növekvő ionszilárdságú puffert használnak, a kötött anyag cserélhető az eluensben lévő ionokkal és eluálható az oldatba. Mivel a különböző anyagok eltérő töltésekkel és eltérő kötési képességekkel rendelkeznek az ioncserélő oszlopmal, az oldatba történő eluálási sorrend szintén eltérő.

(3) Hidrofób kromatográfia: A fehérjék hidrofób képességének felhasználásával a hidrofób maradékok a denaturáció után vagy a magas só környezetben a fehérjék felületén vannak kitéve, a különböző fehérjék hidrofób maradékai a leggyengébb és a legerősebb komponensek által a legkeményebb és a legerősebb komponensek által a legszebb és a legerősebb komponensek általi erősségeivel használhatók. alacsony.

(4) Affinitás -kromatográfia: A tisztítandó (vagy a fehérjére címkézendő fehérje) specifikus ligandumát kovalensen rögzítik a hordozómolekulához megfelelő kémiai módszerekkel. Amikor a fehérjekeveréket hozzáadjuk a affinitási tápközeggel töltött kromatográfiás oszlophoz, a tisztítandó fehérjét kifejezetten a ligandumhoz kötik, míg a többi fehérjét nem kötik és eltávolítják mosással, és a kifejezetten kötött fehérjét szabadon megfelelő ligandum oldattal lehet eluálni. A specifikusan kötött fehérjék eluálhatók egy ingyenes, megfelelő ligandumot tartalmazó oldattal.

4 、 A fehérjetisztító címkék kiválasztása:

A különböző címkék jellemzői a következők: ↓

His-Tag tisztítás: A His-Tag az egyik leggyakrabban használt címke, ahol 6-10 hisztidint adnak a fehérje amino- vagy karboxil-terminálisához, és a célfehérjét tisztítják annak képessége, hogy szorosan kötődjön az Ni2+ kelátképző oszlopokhoz normál vagy denaturációs körülmények között (pl. 8m karbamid), majd az imidazole-val.

Laboratóriumi reagensek:

IPTG; LB közepes;

Lízispuffer: 20 mm Tris (7,9), 500 mm NaCl, 10 mm imidazol;

Mosó puffer: 20 mm -es Tris (7,9), 500 mm NaCl, 20 mM imidazol;

Elube puffer: 20 mm -es Tris (7,9), 200 mm NaCl, 300 mm imidazol ( az imidazol koncentrációja az eluálás hatékonyságának megfelelően beállítható );

Dialízis oldat: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10% glicerin;

Kaomas ragyogó kék festési oldat; elpusztító megoldás

Eszközök:

Ni-NTA, ultrahangos megszakító, kromatográfiás oszlop, koncentrációcsövek

1 、 Prokarióta expressziós plazmid felépítése: a célgén PCR -je, vektor emésztés, ligálás, transzformáció, egy klón szekvenálásához;

2 、 A sikeresen felépített plazmid átalakítását BL21 -ként (DE3), inkubáljuk 37 ℃ -en egy éjszakán át, és válassza ki az egyetlen klónt a kis remegéshez egy éjszakán át;

3 、 Kis indukció a legjobb indukciós feltételek megtudására: Az éjszakai baktérium-oldat 1: 1000 baktérium-oldat 3 ml lb-re, 37 ℃ rázva 4-5 órát rázva az OD600 baktérium oldatra = 0,6-0,8, adjon hozzá különböző IPTG-koncentrációkat (0,1-1 mm), különböző hőmérsékleteket, a 30-os indítványt, az indítványt, az indítványt, mint például a 37 ℃. Az indukált 6H-8H, 16 ℃ indukált 16-20H, 16 ° C-os indukált 16-20 órás, a hőmérséklet csökken, az idő meghosszabbodva, például 37 ℃ indukált 4-5H, 30 ℃ indukált 6H-8H, 16 ° C indukált 16-20h, a hőmérsékletet csökkentik. C 16-20 órán keresztül vegye be a baktérium-SAP-t az indukció előtt és után, különböző indukciós körülmények között, futtassa a gélt, foltot és figyeljen meg az indukció eredményeit; (Általánosságban elmondható, hogy minél alacsonyabb az IPTG koncentrációja és annál alacsonyabb az indukciós hőmérséklet, annál lassabb a célfehérje expressziója, annál inkább elősegíti a fehérjék helyes hajtogatását, ezáltal növelve oldhatóságukat és csökkentve a beillesztési testek képződését)

4 、 Miután megtalálta a legmegfelelőbb indukciós körülményeket, oltja be az 1: 1000 baktériumoldatot 2L lb-re, rázza meg 37 ℃-en, amíg a baktérium oldat OD600-ja = 0,6-0,8, a baktérium oldatának 20 μl-es szpirált baktériumi oldatának a baktériumi megoldása alatt a 20 μl-t a baktériumi oldatban, a preexperimentum és az aspirate-oL-oL-oL-oL-os baktériumi oldat alatt, a Preexermentum és a Aspirate-ben. és hagyja, hogy futtassa a gélt (2);

5 、 Távolítsa el az indukált bakteriális folyadékot, centrifugálva 4000 g -nál 15 percig 4 ℃ -en;

6 、 Dobja el a felülúszót, mérje meg, adjon hozzá 10 ml -es lízispuffert (1: 100 plusz proteázgátlót) minden baktérium grammhoz, resuspend, tegyen jégre kb. 30 percig;

7 、 Nyomás-összetörés: Hagyja el az alkoholt a nagynyomású homogenizátorban, öblítse le vízzel kétszer, használjon lízispuffert az egyszeri kiegyensúlyozáshoz, adja hozzá a baktérium folyadékot, a nyomás alatt (a nyomás nem haladhatja meg a 800 kPa-t), a baktériumfolyadékot három-öt alkalommal átlátszó és nem ragadós;

8 、 Gyűjtse össze a zúzott bakteriális folyadékot, 12000 g, 4 ℃ centrifugálást 20 percig, a felülúszót és a csapadék elválasztását, mindegyik megtartotta a 20 μl mintát (3) (4), hogy gél legyen;

9、2ml Ni-NTA-t adunk a tisztító oszlophoz, hogy etanolszűrjük, vízzel öblítsük, és hozzáadott lízispuffert adunk az oszlop kiegyenlítéséhez;

10 、 lízispufferrel Ni-NTA újraszuszpendenssel, amelyet a felülúszóhoz adtak hozzá, keverjük össze, 4 ℃ Shaker inkubálás 2H-ra;

11

12 、 Mossa meg az oszlopot 5 ml -es mosópufferrel háromszor, gyűjtse össze a szűrletmintát 20 μl (6);

13 、 Adjon hozzá 1 ml -es elúciós puffert, inkubáljon 5 percig, összegyűjtse az eluátumot, ismételje meg ötször, összegyűjtse az 5 ml eluate -t ​​ugyanabban a csőben, hagyjon 20 μl mintát (7);

14 、 A kísérlet során nyert egyes fehérjemintákat futtattuk, 1 órás CAUMA -kkal festettük, és el nem fejezték, amíg a háttér kék szín világosabb és tiszta fehérjetartalmú nem volt látható;

15 、 Elemezze az egyes minták fehérje sávjait, a következő művelet eredményei szerint: Ha a protein eluált fehérje mintái heterozigóta sávok vagy heterozigóta sávok vagy kevesebb, és sekélyek lehetnek, akkor a dialízis és a koncentráció, ha több heterozigóta sávot kell megtisztítaniuk a diarikás és a koncentráció után.

16 、 Dialízis: Adja hozzá a mintát a dialízis membránjába, mindkét végét rögzítse, a dialízist 4 ℃ -en egy éjszakán át;

17 、 Koncentráció: A minta molekulatömeg-mérete szerint a megfelelő koncentrációcsövet választja ki 4 ℃ Alacsony sebességű koncentráció, a fehérjekoncentráció mérésének koncentrációja, jelölés, folyékony nitrogén gyorsfagyasztásban, majd -80 ℃ hűtőszekrényben fagyasztva.

Az alábbi ábra a GFP protein affinitás tisztításának kofection -diagramját mutatja in vitro, és a tisztított fehérje tisztasága és koncentrációja jelentősen megnövekszik