Eiwitzuivering    is het proces van het introduceren van nucleïnezuursequenties die coderen voor eiwitten in gastheercellen door middel van genetische engineeringtechnieken, waardoor ze in grote hoeveelheden tot expressie worden gebracht, en ze vervolgens in vitro te zuiveren met behulp van geschikte zuiveringsmethoden om eiwitten met hoge zuiverheid, activiteit en opbrengst te verkrijgen . Eiwitexpressiesystemen kunnen worden gecategoriseerd in prokaryotische systemen en eukaryotische systemen.

De principes en methoden voor het induceren van eiwitexpressie in prokaryotische systemen en het zuiveren van eiwitten in vitro met behulp van affiniteitchromatografie worden hieronder beschreven.

1 、 Negatieve regulering van de lactose -manipulator:

Bij afwezigheid van lactose bevindt de LAC -manipulator zich in een staat van afschrikking, op welk tijdstip de I -sequentie het LAC afschrikkende eiwit tot expressie brengt om aan de O -sequentie te binden, waardoor RNA -polymerase niet bindt aan de p -sequentie en de transcriptie -initiatie remmen. Wanneer lactose aanwezig is, komt lactose de cel binnen en wordt gekatalyseerd door β-galactosidase en omgezet in isolactose, die bindt aan het remmende eiwit, waardoor een conformationele verandering in het eiwit wordt veroorzaakt en leidt tot dissociatie van het remmende eiwit uit de O-sequentie, waardoor de transcriptie wordt ingevoerd.

Isopropylthiogalactoside (IPTG) werkt op dezelfde manier als isogalactose en is een extreem krachtige inductor die niet wordt gemetaboliseerd door bacteriën en zeer stabiel is en wordt daarom op grote schaal gebruikt in laboratoria.

2 、 Selectie van hoststam:

(1) BL21 is one of the most commonly used strains for prokaryotic expression, which is mainly suitable for the expression of non-toxic proteins with E. coli polymerase, so it can be applied to the expression of prokaryotic systems using E. coli RNA polymerase such as tac or trc (eg pGEX, pMAL plasmids).

(2) BL21(DE3) integrates the T7 phage RNA polymerase gene in the λ phage DE3 region on the chromosome of BL21 strain, which can express both T7 RNA polymerase and E. coli RNA polymerase , and can be used for the expression of plasmids such as the pET series, pGEX, pMAL, and so on.

3, Eiwitzuiveringsmethoden:

(1) Gel filtration chromatography: according to the molecular size from the mixture to separate proteins, the shape of different proteins and the molecular size of the differences in the mixture through the gel filtration chromatography column containing filler particles, due to the molecular size of various proteins are different, the diffusion into the specific size of the aperture particles of the ability to vary, the larger the protein molecules will be the Als eerste uit de moleculen worden geëlueerd, zijn ze kleiner naarmate de elutie later kleiner is.

(2) ionenuitwisselingchromatografie: eiwitscheiding en zuivering is gebaseerd op de verschillende ladingen op het oppervlak van het eiwit, het oppervlak van het eiwit is meestal uniform geladen en kan worden gecombineerd met kation/anionuitwisselingskolommen onder bepaalde omstandigheden. Wanneer de pH wordt gewijzigd of een buffer met geleidelijk toenemende ionsterkte wordt gebruikt voor elutie, kan de gebonden stof worden uitgewisseld met de ionen in het eluent en in de oplossing worden geëlueerd. Aangezien verschillende stoffen verschillende ladingen en verschillende bindingsmogelijkheden hebben met de ionenuitwisselingskolom, is de volgorde van geëlueerde oplossing ook anders.

(3) Hydrofobe chromatografie: met behulp van de hydrofobiciteit van eiwitten zullen hydrofobe residuen worden blootgesteld op het oppervlak van eiwitten na denaturatie of in een hoge zoutomgeving, de hydrofobe residuen van verschillende eiwitten hebben verschillende sterkte van de eluentie van de elu van de eluent van de eluent van de eluent. van hoog tot laag.

(4) Affiniteitschromatografie: het specifieke ligand van een te zuivere eiwit (of getagd op het eiwit) wordt covalent bevestigd aan het dragermolecuul door geschikte chemische methoden. Wanneer het eiwitmengsel wordt toegevoegd aan de chromatografische kolom gevuld met affiniteitsmedium, is het te zuivere eiwit specifiek gebonden aan het ligand, terwijl de andere eiwitten niet worden gebonden en verwijderd door wassen, en het specifiek gebonden eiwit kan worden geëlueerd met een oplossing van vrij overeenkomstig ligand. De specifiek gebonden eiwitten kunnen worden geëlueerd met een oplossing die het vrije overeenkomstige ligand bevat.

4 、 Selectie van eiwitzuiveringslabels:

De kenmerken van verschillende labels zijn als volgt ↓

His-tag purificatie: His-tag is een van de meest gebruikte tags, waarbij 6-10 histidine wordt toegevoegd aan het amino- of carboxylterminus van het eiwit, en het doel-eiwit wordt gezuiverd door het vermogen om strak te binden aan Ni2+ chelerende kolommen onder normale of denatureringsomstandigheden (bijv.

Laboratoriumreagentia:

IPTG; Lb medium;

Lysisbuffer: 20 mm Tris (7.9), 500 mm NaCl, 10 mm imidazol;

Wasbuffer: 20 mm Tris (7.9), 500 mm NaCl, 20 mm imidazol;

Elutiebuffer: 20 mm Tris (7.9), 200 mm NaCl, 300 mm imidazol ( Imidazol -concentratie kan worden aangepast volgens de elutie -efficiëntie );

Dialysisoplossing: 20 mm Tris (7.9), 50 mm NaCl, 10% glycerol;

Kaomas briljante blauwe kleuroplossing; ontkleuringsoplossing

Instrumenten:

Ni-NTA, ultrasone breker, chromatografiekolom, concentratiebuizen

1 、 Constructie van prokaryotische expressieplasmide: PCR van doelgen, vectorvertering, ligatie, transformatie, het kiezen van enkele kloon voor sequencing;

2 、 Transformeer het succesvol geconstrueerde plasmide in BL21 (DE3), incubeer bij 37 ℃ overnacht en kies de enkele kloon voor klein schudden 's nachts;

3 、 Kleine inductie om de beste inductiecondities te achterhalen: worden 's nachts bacteriële oplossing 1: 1000 inoculatie in 3 ml LB, 37 ℃ 4-5H schudden naar de bacteriële oplossing OD600 = 0,6-0,8, voegt verschillende concentraties van IPTG (0,1-1 mm), verschillende temperaturen, met de lagere temperatuur, inductietijd toe, zoals 37 ℃ geïnduceerde 4-5H, 30 ℃ Inductie, zoals 37 ℃ geïnduceerde 4-5H, 30 ℃ Inductie, zoals 37 ℃ geïnduceerde 4-5H, 30 ℃ Inductietijd is uitgebreid. Geïnduceerd 6H-8H, 16 ℃ geïnduceerd 16-20H, 16 ° C geïnduceerd 16-20 uur, de temperatuur wordt verlaagd, de tijd wordt verlengd, zoals 37 ℃ geïnduceerd 4-5H, 30 ℃ geïnduceerd 6H-8H, 16 ° C geïnduceerd 16-20H, wordt de temperatuur verlaagd. C voor 16-20H, neem het bacteriële sap voor en na inductie onder verschillende inductieomstandigheden, voer de gel uit, vlek en observeer de resultaten van inductie; (Over het algemeen, hoe lager de concentratie van IPTG en hoe lager de inductietemperatuur, hoe langzamer de expressie van het doel -eiwit, des te bevorderlijker voor de juiste vouwing van eiwitten, waardoor hun oplosbaarheid wordt vergroot en het genereren van inclusielichamen wordt verminderd)

4 、 Nadat u de meest geschikte inductiecondities hebt gevonden, schudt u de bacteriële oplossing 1: 1000 in 2l LB in 37 ℃ tot de OD600 van de bacteriële oplossing = 0,6-0,8, aspiratie 20μl van de bacteriële oplossing en ASPRACATE 20 μl van de bacteriële oplossing en aspiratie van de bacterische oplossing en aspiratie 20μl van de bacterische oplossing en aspiratie 20μl van de bacterische oplossing en aspiratie van de bacterische oplossing en aspiraat 20μl van de bacterische oplossing, en de bacterische oplossing, en de bacterische oplossing. en laat het de gel (2) laten draaien;

5 、 Verwijder de geïnduceerde bacteriële vloeistof, centrifuge bij 4000 g gedurende 15 minuten bij 4 ℃;

6 、 Gooi de supernatant weg, weeg, voeg 10 ml lysisbuffer toe (1: 100 plus proteaseremmer) voor elke gram bacteriën, resuspend, plaats op ijs gedurende ongeveer 30 minuten;

7 、 Drukgebroken: leg de alcohol uit in de hogedruk homogenizer, spoel tweemaal met water, gebruik lysisbuffer om eenmaal in evenwicht te brengen, voeg de bacteriële vloeistof toe, druk (druk mag niet hoger zijn dan 800 kpa), de bactervloeistof over drie tot vijf keer tot transparant en niet plakkerig;

8 、 Verzamel de geplette bacteriële vloeistof, 12000 g, 4 ℃ centrifugatie voor 20 minuten, de supernatant en neerslagscheiding, elk behouden 20 μl monster (3) (4) om gel te lopen;

9、2 ml Ni-NTA werd toegevoegd aan de zuiveringskolom, om ethanol te filteren, gespoeld met water en toegevoegde lysisbuffer om de kolom in evenwicht te brengen;

10 、 Met lysisbuffer Ni-NTA-resuspensie toegevoegd aan de supernatant, mix goed, 4 ℃ Shaker-incubatie gedurende 2H;

11 、 Het supernatant werd door de kolom geleid bij 4 ° C en 20 ul filtraat werd verzameld (5);

12 、 Was de kolom 3 keer met 5 ml wasbuffer, verzamel het filtraatmonster 20μl (6);

13 、 Voeg 1 ml elutiebuffer toe, incubeer voor 5 minuten, verzamel de eluaat, herhaal 5 keer, verzamel 5 ml eluaat in dezelfde buis, laat 20 μl monster achter (7);

14 、 De afzonderlijke eiwitmonsters verkregen in de loop van het experiment werden uitgevoerd, gekleurd met kauma's briljant blauw gedurende 1 uur, en ontkleurd totdat de achtergrondblauwe kleur lichter was en heldere eiwitbanden zichtbaar waren;

15 、 Analyseer de eiwitbanden van elk monster, volgens de resultaten van de daaropvolgende werking: als de geëlueerde eiwitmonsters in het eiwit zonder heterozygote banden of heterozygote banden of minder en ondiep, kunnen dialysis en concentratie zijn, als meer heterozygoot banden opnieuw moeten worden gezuiverd na dialysisis en concentratie.

16 、 dialysis: voeg het monster toe aan het dialysemembraan, klem beide uiteinden vast, dialyse bij 4 ℃ overnacht;

17 、 Concentratie: volgens de molecuulgewichtgrootte van het monster om de juiste concentratiebuis te kiezen 4 ℃ lage snelheidsconcentratie, concentratie van eiwitconcentratiemeting, labeling, in vloeibare stikstof snel bevriezen en vervolgens ingevroren in -80 ℃ koelder.

De onderstaande figuur toont een Kofection -grafiek van GFP -eiwitaffiniteitszuivering in vitro, en de zuiverheid en concentratie van het gezuiverde eiwit is sterk verhoogd