Proteinrensing    er prosessen med å innføre nukleinsyresekvenser som koder for proteiner i vertsceller gjennom genetisk ingeniørteknikker, noe som får dem til å uttrykkes i store mengder, og deretter rense dem in vitro ved bruk av passende rensemetoder for å oppnå proteiner med høy renhet, aktivitet og utbytte . Proteinuttrykkssystemer kan kategoriseres i prokaryote systemer og eukaryote systemer.

Prinsippene og metodene for å indusere proteinuttrykk i prokaryote systemer og rense proteiner in vitro ved bruk av affinitetskromatografi er beskrevet nedenfor.

1 、 Negativ regulering av laktosemanipulatoren:

I fravær av laktose er LAC -manipulatoren i en avskrekkingstilstand, da I -sekvensen uttrykker LAC avskrekkende protein for å binde seg til O -sekvensen, forhindrer RNA -polymerase fra å binde seg til P -sekvensen og hemme transkripsjonsinitiering. Når laktose er til stede, kommer laktose inn i cellen og katalyseres av ß-galaktosidase og omdannes til isolaktose, som binder seg til det hemmende proteinet, noe som forårsaker en konformasjonsendring i proteinet og fører til dissosiasjon av det hemmende proteinet fra O-sekvensen, derved initiating transkripsjon.

Isopropylthiogalactoside (IPTG) virker på samme måte som isogalaktose og er en ekstremt potent inducer som ikke er metabolisert av bakterier og er veldig stabil, og som derfor er mye brukt i laboratorier.

2 、 Valg av vertsstammer:

(1) BL21 er en av de mest brukte stammene for prokaryotisk uttrykk, som hovedsakelig er egnet for ekspresjon av ikke-giftige proteiner med E. coli-polymerase, så den kan brukes på ekspresjon av prokaryote systemer ved bruk av E. coli RNA-polymerase som TAC eller TRC (f.eks. PGEX, pmal plasmets.

(2) BL21 (DE3) integrerer T7 -fag -RNA -polymerasegenet i λ -fag DE3 -regionen på kromosomet til BL21 -stamme, som kan uttrykke både T7 RNA -polymerase og E. coli RNA -polymerase , og kan brukes til ekspresjon av plasmid som PET -serien, Pgex, PM, PMAL, PMAL, PGAL, PGEx, PMAL, PGAL, PGEx, PMAL, PRE.

3, Proteinrensingsmetoder:

(1) Gelfiltreringskromatografi: I henhold til molekylstørrelsen fra blandingen til å skille proteiner, formen på forskjellige proteiner og molekylstørrelsen på forskjellene i blandingen gjennom gelfiltreringskromatografikolonnen, inneholder fyllstoffpartiklene, på grunn av molekylæren av forskjellige proteiner som er forskjellige, den spesifikke størrelsen av den apte -størrelsen av den store størrelsen som den er den spesifikke størrelsen til den spesifikke størrelsen av den spesifikke størrelsen til den spesifikke størrelsen av den spesifikke størrelsen til den spesifikke størrelsen av den spesifikke størrelsen av størrelsen til forskjellige proteiner, er forskjellig, som inneholder den spesifikke størrelsen til den spesifikke størrelsen av størrelsen av forskjellige proteiner, er forskjellig, som inneholder den spesifikke størrelsen. Molekyler vil være de første som blir eluert ut av molekylene er mindre, jo senere, jo senere eluering.

(2) Ionutvekslingskromatografi: Proteinseparasjon og rensing er basert på de forskjellige ladningene på overflaten av proteinet, overflaten av proteinet er vanligvis jevnt ladet, og kan kombineres med kation/anionbytte -søyler under visse forhold. Når pH endres eller en buffer med gradvis økende ionestyrke brukes til eluering, kan det bundne stoffet byttes med ionene i elueringsmidlet og eluert i løsningen. Siden forskjellige stoffer har forskjellige ladninger og forskjellige bindingsevner med ionutvekslingskolonnen, er rekkefølgen på å bli eluert til løsning også annerledes.

(3) Hydrofob kromatografi: Ved bruk Ionisk styrke av elueringsmidlet i rekkefølge fra høyt til lavt.

(4) Affinitetskromatografi: Den spesifikke liganden av et protein som skal renses (eller tagges på proteinet) er kovalent festet til bærermolekylet ved passende kjemiske metoder. Når proteinblandingen tilsettes den kromatografiske kolonnen fylt med affinitetsmedium, er proteinet som skal renses spesifikt bundet til liganden, mens de andre proteinene ikke er bundet og fjernet ved vasking, og det spesifikt bundne proteinet kan elueres med en løsning av fritt tilsvarende ligand. De spesifikt bundne proteiner kan elueres med en løsning som inneholder den frie tilsvarende liganden.

4 、 Valg av proteinrensingsetiketter:

Egenskapene til forskjellige etiketter er som følger ↓

His-tag-rensing: His-tag er en av de mest brukte taggene, der 6-10 histidin tilsettes til aminoen eller karboksylterminalen til proteinet, og målproteinet blir renset ved sin evne til å binde seg tett til Ni+ og deretter elveponert under normal eller denaturende forhold (f.eks. 8M til Ni. og deretter eli-kolonner under normal eller denaturende forhold (f.eks. brønner).

Laboratorireagenser:

IPTG; Lb medium;

Lysisbuffer: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 10 mM imidazol;

Vaskbuffer: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCl, 20 mM imidazol;

Elueringsbuffer: 20mm Tris (7,9), 200 mm NaCl, 300mm imidazol ( imidazolkonsentrasjon kan justeres i henhold til elueringseffektiviteten );

Dialyseløsning: 20 mm Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10% glyserol;

Kaomas strålende blå fargeløsning; avfarge løsning

Instrumenter:

Ni-NTA, Ultrasonic Breaker, Chromatography Column, Konsentrasjonsrør

1 、 Konstruksjon av prokaryotisk ekspresjonsplasmid: PCR av målgen, vektorfordøyelse, ligering, transformasjon, plukking av enkeltklon for sekvensering;

2 、 Transformer det vellykket konstruerte plasmidet til BL21 (DE3), inkuber ved 37 ℃ over natten, og velg den enkeltklonen for liten risting over natten;

3 、 Liten induksjon for å finne ut de beste induksjonsbetingelsene: vil bli ristet over natten bakteriell løsning 1: 1000 inokulering i 3 ml lb, 37 ℃ Risting 4-5 timer til bakteriell løsning OD600 = 0,6-0,8, tilfører 4-5-talls-temperaturen (0,1-1m), som 37-en-induksjonen, med den nedleggelsen av temperaturen (0,1-1 m) ℃ Indusert 6H-8H, 16 ℃ Indusert 16-20 timer, 16 ° C indusert 16-20 timer, temperaturen reduseres, tiden er utvidet, slik som 37 ℃ indusert 4-5 timer, 30 ℃ indusert 6H-8H, 16 ° C indusert 16-20H, temperaturen reduseres. C I 16-20H, ta bakteriesaften før og etter induksjon under forskjellige induksjonsbetingelser, kjør gelen, flekken og observer resultatene av induksjon; (Generelt sett, jo lavere konsentrasjon av IPTG og jo lavere induksjonstemperatur, jo saktere uttrykket av målproteinet, desto mer bidrar til riktig folding av proteiner, og derved øke deres løselighet og redusere generering av inkluderingslegemer)

4 、 Etter å ha funnet de mest passende induksjonsbetingelsene, inokulert bakteriell løsning 1: 1000 i 2L LB, rist ved 37 ℃ til OD600 av bakteriell løsning = 0,6-0,8, aspirat 20 ul av bakterioppløsningen og la det være preftens for å få den preepsjonen til å oppnå den som er i forhold til det, og som blir det for å få den pre-ene til å få gel ( bakteriell løsning og lar den kjøre gelen (2);

5 、 Fjern den induserte bakterievæsken, sentrifuge ved 4000g i 15 minutter ved 4 ℃;

6 、 Kast supernatanten, veie, tilsett 10 ml lysisbuffer (1: 100 pluss proteaseinhibitor) for hvert gram bakterier, resuspender, legg på is i omtrent 30 minutter;

7 、 Trykksknusing: Sett av alkoholen i høytrykkshomogenisatoren, skyll med vann to ganger, bruk lysebuffer for å balansere en gang, tilsett bakterievæsken, trykk (trykk skal ikke overstige 800kpa), bakterievæsken over tre til fem ganger til transparent og ikke klissete;

8 、 Samle den knuste bakterievæsken, 12000g, 4 ℃ sentrifugering i 20 minutter, supernatanten og bunnfallets separasjon, hver beholdt 20μL prøve (3) (4) for å bli kjørt gel;

9、2ml Ni-NTA ble tilsatt til rensekolonnen, for å bli etanolfiltrert, skylt med vann og tilsatt lysebuffer for å ekvilibrere kolonnen;

10 、 Med lysisbuffer Ni-NTA resuspensjon lagt til supernatanten, bland godt, 4 ℃ Shaker-inkubasjon for 2H;

11 、 Supernatanten ble ført gjennom kolonnen ved 4 ° C, og 20 ul filtrat ble samlet (5);

12 、 Vask kolonnen med 5 ml vaskebuffer 3 ganger, samle filtratprøven 20μL (6);

13 、 Tilsett 1 ml elueringsbuffer, inkuber i 5 minutter, samle eluatet, gjenta 5 ganger, samle 5 ml eluat i samme rør, la 20 ul prøve (7);

14 、 De individuelle proteinprøvene oppnådd i løpet av eksperimentet ble kjørt, farget med Caumas strålende blå i 1H, og avfarget til bakgrunnsblå farge var lettere og klare proteinbånd var synlige;

15 、 Analyser proteinbåndene i hver prøve, i henhold til resultatene fra den påfølgende operasjonen: Hvis de eluerte proteinprøvene i proteinet uten heterozygote bånd eller heterozygote bånd eller mindre og grunt, kan diysis og konsentrasjon og konsentrasjon og konsentrasjon.

16 、 Dialyse: Legg prøven i dialysemembranen, klem begge ender, dialyse ved 4 ℃ over natten;

17 、 Konsentrasjon: I henhold til molekylvektstørrelsen til prøven for å velge passende konsentrasjonsrør 4 ℃ Lavhastighetskonsentrasjon, konsentrasjon av proteinkonsentrasjonsmåling, merking, i flytende nitrogen hurtigfrysing og deretter frosset i -80 ℃ kjøleskap.

Figuren nedenfor viser et kofeksjonsplott av GFP -proteinaffinitetsrensing in vitro, og renheten og konsentrasjonen av det rensede proteinet er sterkt økt