タンパク質精製は    、遺伝子工学技術を介してタンパク質を宿主細胞にコードする核酸配列を導入し、それらを大量に発現させ、 高純度、活性、収量のタンパク質を得るために適切な精製方法を使用してin vitroで精製するプロセスです。タンパク質発現システムはに分類できます 、原核生物系 と 真核生物系.

ための原理と方法 原核生物系にタンパク質発現を誘導し 、 アフィニティクロマトグラフィーを使用してin vitroでタンパク質を精製する を以下に説明します。

1、乳糖マニピュレーターの負の調節：

乳糖が存在しない場合、LACマニピュレーターは抑止状態にあり、その時点でIシーケンスはLAC抑止タンパク質を発現してO配列に結合し、RNAポリメラーゼがP配列に結合し、転写開始を阻害するのを防ぎます。乳糖が存在すると、乳糖は細胞に入り、β-ガラクトシダーゼによって触媒され、阻害性タンパク質に結合し、タンパク質の立体構造変化を引き起こし、O配列からの阻害性タンパク質の解離を引き起こし、それによって転写を開始します。

イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）は、イソガラクトースと同じように作用し、細菌によって代謝されず、非常に安定しているため、研究室で広く使用されている非常に強力な誘導剤です。

2、ホストひずみ選択：

（1）BL21は原核生物発現に最も一般的に使用される株の1つであり、主に大腸菌ポリメラーゼを伴う 非毒性タンパク質の発現に 適しているため、TACやTRCなどの大腸菌RNAポリマーゼを使用した原核生物系の発現に適用できます（EG PGEX、PMALプラスミド）。

（2）BL21（DE3）は、BL21株の染色体上のλファージDE3領域のT7ファージRNAポリメラーゼ遺伝子を統合し、 T7 RNAポリメラーゼと大腸菌RNAポリメラーゼの両方を発現し、PETシリーズ、PGEX、PMALなどのプラスミドの発現に使用できます。

3、タンパク質精製方法：

（1）ゲルろ過クロマトグラフィー： 混合物から分離タンパク質への分子サイズ、異なるタンパク質の形状、およびさまざまなタンパク質の分子サイズのために、充填剤粒子を含むゲルろ過クロマトグラフィーカラムを介した混合物の違いの分子サイズによると、さまざまなタンパク質の分子サイズが異なります。分子から最初に溶出するのは小さいほど小さいほど後で溶出します。

（2）イオン交換クロマトグラフィー： タンパク質分離と精製は、タンパク質の表面の異なる電荷に基づいており、タンパク質の表面は通常均一に充電され、特定の条件下で陽イオン/アニオン交換カラムと組み合わせることができます。 pHが変更されるか、溶出にイオン強度が徐々に増加するバッファーが溶出に使用されると、結合物質を溶離液のイオンと交換し、溶液に溶出できます。異なる物質には異なる電荷があり、イオン交換カラムと異なる結合能力があるため、溶液に溶出する順序も異なります。

（3）疎水性クロマトグラフィー： タンパク質の疎水性を使用して、疎水性残基は変性後または高塩環境でタンパク質の表面に露出します。高から低いまで溶接性のイオン強度。

（4）アフィニティクロマトグラフィー： 精製されるタンパク質の特定のリガンド（またはタンパク質にタグ付け）は、適切な化学法によってキャリア分子に共有結合します。タンパク質混合物をアフィニティ培地で満たされたクロマトグラフィックカラムに加えた場合、精製するタンパク質は特異的にリガンドに結合しますが、他のタンパク質は洗浄によって結合されて除去されず、特異的に結合したタンパク質は遊離対応リガンドの溶液で溶出できます。特異的に結合したタンパク質は、遊離対応するリガンドを含む溶液で溶出できます。

4、タンパク質精製ラベルの選択：

異なるラベルの特性は、次のとおりです↓

His-Tag Purification：HIS-TAGは、最も一般的に使用されるタグの1つであり、6〜10のヒスチジンがタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端に添加され、標的タンパク質は、正常または系統の条件または脱塩条件（たとえば、8M尿素）でNi2+キレートカラムにしっかりと結合する能力によって精製され、その後、イミダゾールに溶けます（競合）。

実験室の試薬：

iptg; LB培地;

溶解バッファー：20 mm Tris（7.9）、500 mm NaCl、10 mMイミダゾール。

洗浄バッファー：20 mm Tris（7.9）、500 mm NaCl、20 mMイミダゾール。

溶出バッファー：20mm Tris（7.9）、200mm NaCl、300mmイミダゾール（溶出効率に応じてイミダゾール濃度を調整できます）。

透析溶液：20 mm Tris（7.9）、50 mM NaCl、10％グリセロール。

Kaomasブリリアントブルー染色ソリューション。脱色ソリューション

楽器：

NI-NTA、超音波ブレーカー、クロマトグラフィーカラム、濃度チューブ

1 lo慢性発現プラスミドの構造：標的遺伝子のPCR、ベクター消化、ライゲーション、形質転換、シーケンスのための単一クローンのピッキング。

2は、正常に構築されたプラスミドをBL21（DE3）に変換し、37℃で一晩インキュベートし、一晩で小さな揺れのために単一のクローンを選びます。

3.最良の誘導条件を調べるための小さな誘導：一晩の細菌溶液1：1000の接種を3ml lb、37℃細菌溶液OD600 = 0.6-0.8に4-5Hで揺れ、iptg（0.1-1mm）の異なる濃度を加え、異なる温度を追加します。誘導6H-8H、16は誘導された16-20H、16°Cは16-20Hを誘導し、温度を低下させ、37℃誘導誘導誘導誘導6H-8H、16°C誘導誘導16-20Hなど、温度が低下します。 16-20Hでは、さまざまな誘導条件下で誘導の前後に細菌の樹液を服用し、ゲルを実行し、染色し、誘導の結果を観察します。 （一般的に、IPTGの濃度が低くなり、誘導温度が低いほど、標的タンパク質の発現が遅くなるほど、タンパク質の正しい折り畳みを助長し、それにより溶解度が高まり、包摂体の生成が減少します）

4、After finding the most suitable induction conditions, inoculate the bacterial solution 1:1000 into 2L of LB, shake at 37℃ until the OD600 of the bacterial solution=0.6-0.8, aspirate 20μL of the bacterial solution and leave it to run the gel (1), then induce the protein expression under the suitable induction conditions obtained in the pre-experiment, and aspirate 20μL of the bacterial solutionゲルを実行するためにそれを残してください（2）;

5 dever誘導された細菌の液体を除去し、400分に4000gで遠心分離します。

6は、上清を捨て、計量し、細菌のグラムごとに10mlの溶解バッファー（1：100プラスプロテアーゼ阻害剤）を加え、再懸濁し、氷上に約30分間置きます。

7、圧力粉砕：高圧ホモジナイザーでアルコールを延期し、水で2回洗い流し、溶解緩衝液を使用してバランスをとり、細菌の液体、加圧（800kpaを超えないでください）、細菌の液体は3〜5回、透明ではなく粘着性があります。

8は、20分間、砕いた細菌液、12000g、4℃遠心分離、上清と沈殿物の分離を収集し、それぞれ20μLサンプル（3）（4）を保持して走行する。

9〜2ml Ni-NTAを精製カラムに加え、エタノールろ過し、水ですすいで溶解バッファーを加えてカラムを平衡化しました。

10 lysis溶解バッファーを使用して、上清に追加されたni-nta再懸濁を使用して、2時間の4℃シェーカーインキュベーションを混合します。

11、上清を4°Cでカラムに通し、20μlのろ液を収集しました（5）。

12は5mlの洗浄バッファーで3回カラムを洗浄し、ろ液サンプル20μl（6）を収集します。

13は1ml溶出バッファーを加え、5分間インキュベートし、溶出物を収集し、5回繰り返し、5mlの溶出物を同じチューブに集め、20μlのサンプルを残します（7）。

14 redifertion実験の過程で得られた個々のタンパク質サンプルを実行し、1時間の鮮やかな青色で染色し、背景青色が軽くて透明なタンパク質バンドが見えるまで脱色しました。

15は、後続の操作の結果に従って、各サンプルのタンパク質バンドを分析します。ヘテロ接合バンドまたはヘテロ接合バンド以下の浅いバンドなしのタンパク質の溶出されたタンパク質サンプルは、透析と濃度を透析と濃度にする必要がある場合、透析と濃度を再び精製する必要があります。

16、透析：サンプルを透析膜に追加し、両端を締め、透析を4℃で一晩締めます。

17 devention濃度：適切な濃度チューブを選択するためのサンプルの分子量サイズに従って、低速濃度、タンパク質濃度測定の濃度、標識、液体窒素速度凍結、および-80℃冷却器で凍結します。

以下の図は、in vitroでのGFPタンパク質親和性精製のコフェクションプロットを示しており、精製されたタンパク質の純度と濃度が大幅に増加しています