タンパク質精製    は、遺伝子工学技術によってタンパク質をコードする核酸配列を宿主細胞に導入し、それらを大量に発現させ、その後、 高純度、活性、および収量のタンパク質を得るために、適切な精製方法を使用してそれらをインビトロで精製するプロセスです。タンパク質発現システムは、に分類できます。 原核生物システム と 真核生物システム.

ための原理と方法を 原核生物系でタンパク質発現を誘導し 、 アフィニティークロマトグラフィーを使用してインビトロでタンパク質を精製する 以下に説明します。

1、乳糖マニピュレーターの負の制御:

ラクトースの非存在下では、lacマニピュレーターは抑止状態にあり、このときI配列はLac抑止タンパク質を発現してO配列に結合し、RNAポリメラーゼがP配列に結合するのを防ぎ、転写開始を阻害します。ラクトースが存在すると、ラクトースは細胞に入り、β-ガラクトシダーゼによって触媒されてイソラクトースに変換され、阻害タンパク質に結合してタンパク質の立体構造変化を引き起こし、O配列からの阻害タンパク質の解離を引き起こし、それによって転写を開始します。

イソプロピルチオガラクトシド (IPTG) はイソガラクトースと同様に作用し、細菌によって代謝されず、非常に安定な非常に強力な誘導剤であるため、研究室で広く使用されています。

2、宿主株の選択:

(1) BL21 は、原核生物の発現に最も一般的に使用される株の 1 つであり、主に大腸菌ポリメラーゼによる 非毒性タンパク質の発現 に適しているため、tac や trc などの大腸菌 RNA ポリメラーゼを使用する原核生物系 (pGEX、pMAL プラスミドなど) の発現に適用できます。

(2) BL21(DE3)は、BL21株の染色体上のλファージDE3領域にT7ファージRNAポリメラーゼ遺伝子を組み込んでおり、 T7 RNAポリメラーゼと大腸菌RNAポリメラーゼの両方を発現することができ、pETシリーズ、pGEX、pMALなどのプラスミドの発現に使用できます。

3、タンパク質の精製方法:

(1) ゲル濾過クロマトグラフィー： 混合物からタンパク質を分離するための分子サイズ、異なるタンパク質の形状、および充填粒子を含むゲル濾過クロマトグラフィーカラムを通過する混合物の分子サイズの違いに応じて、さまざまなタンパク質の分子サイズが異なるため、アパーチャ粒子の特定のサイズへの拡散能力が変化し、タンパク質分子が大きいほど最初に溶出される分子が小さくなり、分子が小さくなるほど遅くなります。溶出。

(2) イオン交換クロマトグラフィー: タンパク質の分離と精製はタンパク質表面の異なる電荷に基づいており、タンパク質の表面は通常均一に帯電しており、特定の条件下でカチオン/アニオン交換カラムと組み合わせることができます。 pHを変化させたり、イオン強度が徐々に大きくなる緩衝液を用いて溶出すると、結合物質が溶離液中のイオンと交換されて溶液中に溶出されます。物質が異なれば電荷も異なり、イオン交換カラムとの結合力も異なるため、溶液中に溶出する順序も異なります。

(3) 疎水性クロマトグラフィー: タンパク質の疎水性を利用して、変性後または高塩環境下では疎水性残基がタンパク質の表面に露出します。異なるタンパク質の疎水性残基は固定相の疎水性リガンドとの作用の強さが異なり、溶離液のイオン強度を高いものから低いものの順に使用することにより、疎水性を最も弱い成分から最も強い成分の分離として使用できます。

(4) アフィニティークロマトグラフィー: 精製される (またはタンパク質にタグ付けされる) タンパク質の特定のリガンドが、適切な化学的方法によって担体分子に共有結合します。アフィニティー媒体を満たしたクロマトグラフィーカラムにタンパク質混合物を加えると、精製対象のタンパク質はリガンドに特異的に結合しますが、他のタンパク質は結合せず、洗浄によって除去され、特異的に結合したタンパク質は遊離の対応するリガンドの溶液で溶出することができます。特異的に結合したタンパク質は、遊離の対応するリガンドを含む溶液で溶出できます。

4、タンパク質精製ラベルの選択:

ラベルごとの特徴は以下の通り↓

His タグ精製: His タグは最も一般的に使用されるタグの 1 つであり、タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に 6 ～ 10 個のヒスチジンが付加され、通常または変性条件 (8M 尿素など) で Ni2+ キレートカラムにしっかりと結合する能力によって標的タンパク質が精製され、その後イミダゾール (ビーズウェル内のニッケルイオンとの結合を競合する) で溶出されます。

実験用試薬:

IPTG; LB培地。

溶解バッファー: 20 mM トリス (7.9)、500 mM NaCl、10 mM イミダゾール。

洗浄バッファー: 20 mM トリス (7.9)、500 mM NaCl、20 mM イミダゾール。

溶出バッファー: 20mM Tris (7.9)、200mM NaCl、300mM イミダゾール (イミダゾール濃度は溶出効率に応じて調整できます)。

透析溶液: 20 mM Tris (7.9)、50 mM NaCl、10% グリセロール。

Kaomas Brilliant Blue 染色液;脱色液

楽器:

Ni-NTA、超音波ブレーカー、クロマトグラフィーカラム、濃縮管

1、原核生物発現プラスミドの構築：標的遺伝子のPCR、ベクター消化、ライゲーション、形質転換、配列決定のための単一クローンの選択;

2、正常に構築されたプラスミドを BL21(DE3) に形質転換し、37℃で一晩インキュベートし、単一クローンを選択して一晩軽く振盪します。

3、最適な誘導条件を見つけるための小さな誘導：細菌溶液1：1000を3mL LBに接種し、37℃で4〜5時間振盪して細菌溶液OD600 = 0.6〜0.8に一晩振盪し、異なる濃度のIPTG（0.1〜1mM）、異なる温度を追加し、温度が下がるにつれて誘導時間を延長します（37℃誘導など）。 4-5h、30℃誘導 6h-8h、16℃誘導 16-20h、16℃誘導 16-20h、温度は低下し、時間が延長されます。たとえば、37℃誘導 4-5h、30℃誘導 6h-8h、16℃誘導 16-20h、温度は低下します。 Cで16〜20時間放置し、異なる誘導条件下で誘導の前後に細菌の樹液を採取し、ゲルを泳動し、染色して誘導の結果を観察します。 (一般に、IPTG の濃度が低く、誘導温度が低いほど、標的タンパク質の発現が遅くなり、タンパク質の正しいフォールディングが促進され、その結果、タンパク質の溶解度が増加し、封入体の生成が減少します)

4、最適な誘導条件を見つけた後、菌液 1:1000 を 2L LB に接種し、菌液の OD600=0.6-0.8 になるまで 37℃で振盪し、菌液 20μL を吸引してゲルに泳動させます (1)。その後、事前実験で得られた適切な誘導条件下でタンパク質発現を誘導し、20μL を吸引します。細菌溶液をゲルに流し込みます (2)。

5、誘導された細菌液を除去し、4000g、15分間、4℃で遠心分離します。

6、上清を捨て、重量を量り、細菌1グラム当たり10mLの溶解緩衝液（1:100プラスプロテアーゼ阻害剤）を加え、再懸濁し、氷上に約30分間置きます。

7、圧力破砕：高圧ホモジナイザー内のアルコールを除去し、水で2回洗浄し、Lysisバッファーを使用して1回バランスを取り、細菌液を追加し、加圧（圧力は800kpaを超えてはなりません）し、細菌液を3〜5回かけて透明でベタつかないようにします。

8、破砕菌液を収集し、12000g、4℃で20分間遠心分離し、上清と沈殿を分離し、それぞれ20μLのサンプルを保持した(3)(4)ゲルを泳動する。

9、2mLのNi-NTAを精製カラムに加え、エタノール濾過し、水ですすぎ、溶解緩衝液を加えてカラムを平衡化した。

10、Lysis バッファー Ni-NTA 再懸濁液を上清に加え、よく混合し、4 ℃ シェーカーで 2 時間インキュベートします。

11、上清を4℃でカラムに通し、ろ液20μLを回収した(5)。

12、カラムを5mLの洗浄バッファーで3回洗浄し、ろ液サンプル20μLを収集します(6)。

13、1mLの溶出緩衝液を加え、5分間インキュベートし、溶出液を回収することを5回繰り返し、同じチューブに5mLの溶出液を回収し、20μLのサンプルを残す(7);

14、実験中に得られた個々のタンパク質サンプルを分析し、Caumas Brilliant Blue で 1 時間染色し、背景の青色が明るくなり、明確なタンパク質バンドが見えるまで脱色しました。

15、後続の操作の結果に従って、各サンプルのタンパク質バンドを分析します。溶出されたタンパク質サンプルにヘテロ接合性バンドがない、またはヘテロ接合性バンドが少ない、または浅い場合は、透析と濃縮が可能です。より多くのヘテロ接合性バンドが透析と濃縮後に再度精製する必要がある場合は、透析と濃縮後に再度精製する必要があります。

16、透析：サンプルを透析膜に加え、両端をクランプし、4℃で一晩透析します。

17、濃縮：サンプルの分子量サイズに応じて適切な濃縮チューブを選択し、4℃低速濃縮、タンパク質濃度の測定、標識の濃縮、液体窒素で急速凍結し、その後-80℃の冷蔵庫で凍結します。

下の図は、in vitro での GFP タンパク質アフィニティー精製のコフェクションプロットを示しており、精製タンパク質の純度と濃度は大幅に増加しています。