Purificarea proteinelor    este procesul de introducere a secvențelor de acid nucleic care codifică proteinele în celulele gazdă prin tehnici de inginerie genetică, făcându-le să fie exprimate în cantități mari și apoi purificarea lor in vitro folosind metode de purificare adecvate pentru a obține proteine ​​de înaltă puritate, activitate și randament . Sistemele de exprimare a proteinelor pot fi clasificate în sisteme procariote și sisteme eucariote.

Principiile și metodele pentru inducerea expresiei proteinelor în sistemele procariote și purificarea proteinelor in vitro folosind cromatografia de afinitate sunt descrise mai jos.

1, Reglarea negativă a manipulatorului de lactoză:

În absența lactozei, manipulatorul lac este într-o stare de descurajare, moment în care secvența I exprimă proteina de descurajare Lac pentru a se lega de secvența O, împiedicând ARN polimerazei să se lege de secvența P și inhibând inițierea transcripției. Când lactoza este prezentă, lactoza intră în celulă și este catalizată de β-galactozidază și transformată în izoctoză, care se leagă de proteina inhibitoare, provocând o modificare conformațională a proteinei și conducând la disocierea proteinei inhibitoare de secvența O, inițiind astfel transcripția.

Isopropiltiogalactozida (IPTG) acționează în același mod ca izogalactoza și este un inductor extrem de puternic care nu este metabolizat de bacterii și este foarte stabil și, prin urmare, este utilizat pe scară largă în laboratoare.

2, selecția tulpinii gazdă:

(1) BL21 este una dintre cele mai frecvent utilizate tulpini pentru expresia procariotă, care este potrivită în principal pentru exprimarea proteinelor netoxice cu polimeraza E. coli, astfel încât poate fi aplicată la exprimarea sistemelor procariote folosind ARN polimeraza E. coli, cum ar fi tac sau trc (de exemplu pGEX, plasmide pMAL).

(2) BL21(DE3) integrează gena ARN polimerazei fagului T7 în regiunea DE3 a fagului λ de pe cromozomul tulpinii BL21, care poate exprima atât ARN polimeraza T7, cât și ARN polimeraza E. coli și poate fi utilizată pentru exprimarea plasmidelor precum seriile pET, pGEX și pMAL, etc.

3, metode de purificare a proteinelor:

(1) Cromatografia de filtrare pe gel: în funcție de dimensiunea moleculară a amestecului pentru a separa proteinele, forma diferitelor proteine și dimensiunea moleculară a diferențelor amestecului prin coloana de cromatografie de filtrare pe gel care conține particule de umplutură, datorită dimensiunii moleculare a diferitelor proteine sunt diferite, difuzia în dimensiunea specifică a particulelor de deschidere a capacității de a varia, cu cât moleculele vor fi mai mari, primele molecule vor fi mai mari. mai mic cu cât eluția este mai târziu.

(2) Cromatografia cu schimb de ioni: separarea și purificarea proteinelor se bazează pe diferitele sarcini de pe suprafața proteinei, suprafața proteinei este de obicei încărcată uniform și poate fi combinată cu coloane de schimb cationic/anionic în anumite condiții. Când pH-ul este modificat sau se folosește un tampon cu putere ionică în creștere treptată pentru eluare, substanța legată poate fi schimbată cu ionii din eluent și eluată în soluție. Deoarece diferite substanțe au sarcini diferite și abilități de legare diferite cu coloana schimbătoare de ioni, ordinea de eluare în soluție este, de asemenea, diferită.

(3) Cromatografie hidrofobă: Folosind hidrofobicitatea proteinelor, reziduurile hidrofobe vor fi expuse pe suprafața proteinelor după denaturare sau într-un mediu cu multă sare, reziduurile hidrofobe ale diferitelor proteine au puteri diferite de acțiune cu liganzii hidrofobi ai fazei staționare, iar hidrofobicitatea poate fi utilizată ca o componentă slabă de separare a ionilor de la cea mai mare la cea mai puternică. la scăzut.

(4) Cromatografia de afinitate: ligandul specific al unei proteine ​​care trebuie purificată (sau marcat pe proteină) este atașat covalent la molecula purtător prin metode chimice adecvate. Când amestecul de proteine ​​este adăugat la coloana cromatografică umplută cu mediu de afinitate, proteina care trebuie purificată este legată în mod specific de ligand, în timp ce celelalte proteine ​​nu sunt legate și îndepărtate prin spălare, iar proteina legată în mod specific poate fi eluată cu o soluție de ligand liber corespunzător. Proteinele legate în mod specific pot fi eluate cu o soluţie care conţine ligandul corespunzător liber.

4, Selectarea etichetelor de purificare a proteinelor:

Caracteristicile diferitelor etichete sunt următoarele↓

Purificarea lui His-tag: His-tag-ul este una dintre cele mai frecvent utilizate etichete, în care se adaugă 6-10 histidină la capătul amino sau carboxil al proteinei, iar proteina țintă este purificată prin capacitatea sa de a se lega strâns de coloanele de chelare Ni2+ în condiții normale sau denaturante (de exemplu, 8M uree), și apoi este eluată cu nichel imidazo. puțuri de mărgele).

Reactivi de laborator:

IPTG; LB mediu;

Tampon de liză: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCI, 10 mM imidazol;

Tampon de spălare: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCI, 20 mM imidazol;

Tampon de eluție: 20 mM Tris (7,9), 200 mM NaCI, 300 mM imidazol ( concentrația de imidazol poate fi ajustată în funcție de eficiența de eluare );

Soluție de dializă: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCI, 10% glicerol;

Soluție de colorare Kaomas Brilliant Blue; soluție decolorantă

Instrumente:

Ni-NTA, ruptor cu ultrasunete, coloană de cromatografie, tuburi de concentrare

1、Construcția plasmidei de expresie procariotă: PCR a genei țintă, digestia vectorului, ligatura, transformarea, alegerea unei singure clone pentru secvențiere;

2、Transformați plasmida construită cu succes în BL21(DE3), incubați la 37℃ peste noapte și alegeți clona unică pentru agitare mică peste noapte;

3, Mică inducție pentru a afla cele mai bune condiții de inducție: se va agita peste noapte soluție bacteriană 1:1000 inoculare în 3 ml LB, 37 ℃ agitare 4-5 ore la soluția bacteriană OD600 = 0,6-0,8, se adaugă diferite concentrații de IPTG (0,1-1 mM, o astfel de temperatură de inducție extinsă, cu o astfel de scădere a temperaturii ca 37 ℃ indus 4-5h, 30 ℃ indus 6h-8h, 16 ℃ indus 16-20h, 16 °C indus 16-20h, temperatura este redusă, timpul este prelungit, cum ar fi 37 ℃ indus 4-5h, ° C indus 6-6 h, ° C indus 6-6 h, 30 ℃ indus 16-20h, temperatura scade. C timp de 16-20 ore, luați seva bacteriană înainte și după inducție în diferite condiții de inducție, rulați gelul, colorați și observați rezultatele inducției; (În general, cu cât concentrația de IPTG este mai mică și cu cât temperatura de inducție este mai mică, cu atât expresia proteinei țintă este mai lentă, cu atât este mai propice plierea corectă a proteinelor, crescând astfel solubilitatea acestora și reducând generarea de corpuri de incluziune)

4, După ce găsiți cele mai potrivite condiții de inducție, inoculați soluția bacteriană 1:1000 în 2L de LB, agitați la 37℃ până când OD600 a soluției bacteriene = 0,6-0,8, aspirați 20μL de soluție bacteriană și lăsați-o să ruleze gelul (1), apoi induceți expresia de pre-exprimare a proteinei obținută în condiții adecvate de aspirație și aspirați. 20μL de soluție bacteriană și lăsați-o să curgă gelul (2);

5, Îndepărtați lichidul bacterian indus, centrifugați la 4000g timp de 15 minute la 4℃;

6. Aruncați supernatantul, cântăriți, adăugați 10 ml tampon de liză (1:100 plus inhibitor de protează) pentru fiecare gram de bacterii, resuspendați, puneți pe gheață timp de aproximativ 30 de minute;

7, zdrobire sub presiune: îndepărtați alcoolul din omogenizatorul de înaltă presiune, clătiți cu apă de două ori, utilizați tampon Lysis pentru a echilibra o dată, adăugați lichid bacterian, presurizare (presiunea nu trebuie să depășească 800 kpa), lichidul bacterian de peste trei până la cinci ori să fie transparent și nu lipicios;

8, Colectați lichidul bacterian zdrobit, 12000 g, centrifugare 4 ℃ timp de 20 de minute, separarea supernatantului și a precipitatului, fiecare probă reținută de 20μL (3) (4) pentru a fi rulat gel;

S-au adăugat 9,2 ml Ni-NTA la coloana de purificare, pentru a fi filtrat cu etanol, clătit cu apă și s-a adăugat tampon de liză pentru a echilibra coloana;

10、Cu soluția tampon de liză Ni-NTA adăugată la supernatant, amestecați bine, incubare cu agitator la 4 ℃ timp de 2 ore;

11、Supernatantul a fost trecut prin coloană la 4°C și s-au colectat 20 μL de filtrat (5);

12、Spălați coloana cu 5mL tampon de spălare de 3 ori, colectați proba de filtrat 20μL (6);

13、Adăugați 1mL tampon de eluare, incubați timp de 5 minute, colectați eluatul, repetați de 5 ori, colectați 5mL de eluat în același tub, lăsați 20μL de probă (7);

14. Probele individuale de proteine ​​obținute în timpul experimentului au fost colorate cu Caumas Brilliant Blue timp de 1 oră și decolorate până când culoarea albastră de fundal a fost mai deschisă și au fost vizibile benzi de proteine ​​clare;

15, Analizați benzile de proteine ​​ale fiecărei probe, în funcție de rezultatele operațiunii ulterioare: dacă probele de proteine ​​eluate în proteină fără benzi heterozigote sau benzi heterozigote sau mai puține și superficiale, pot fi dializă și concentrare, dacă mai multe benzi heterozigote trebuie purificate din nou după dializă și concentrare.

16, Dializă: adăugați proba în membrana de dializă, fixați ambele capete, dializa la 4℃ peste noapte;

17、Concentrație: în funcție de dimensiunea masei moleculare a probei pentru a alege tubul de concentrație adecvat 4 ℃ concentrație de viteză mică, concentrația de măsurare a concentrației de proteine, etichetare, în congelare rapidă cu azot lichid și apoi congelat în frigider -80 ℃.

Figura de mai jos arată o diagramă de cofecție a purificării afinității proteinei GFP in vitro, iar puritatea și concentrația proteinei purificate sunt mult crescute