Purificarea proteinelor    este procesul de introducere a secvențelor de acid nucleic care codifică proteinele în celulele gazdă prin tehnici de inginerie genetică, determinându -le să fie exprimate în cantități mari și apoi să le purificate in vitro folosind metode de purificare adecvate pentru a obține proteine ​​de puritate ridicată, activitate și randament . Sistemele de expresie proteică pot fi clasificate în sisteme procariote și sisteme eucariote.

Principiile și metodele pentru inducerea expresiei proteice în sistemele procariote și purificarea proteinelor in vitro folosind cromatografie de afinitate sunt descrise mai jos.

1 、 Reglarea negativă a manipulatorului de lactoză:

În absența lactozei, manipulatorul LAC este într -o stare de descurajare, moment în care secvența I exprimă proteina de descurajare a LAC pentru a se lega de secvența O, împiedicând ARN polimeraza de a se lega la secvența P și inhibarea inițierii transcrierii. Când lactoza este prezentă, lactoza intră în celulă și este catalizată de β-galactosidaza și transformată la izolactoză, care se leagă de proteina inhibitoare, provocând o modificare conformațională a proteinei și duce la disocierea proteinei inhibitoare din secvența O, inițialând astfel transcrierea.

Isopropiltiogalactosida (IPTG) acționează în același mod ca izogalactoza și este un inductor extrem de puternic care nu este metabolizat de bacterii și este foarte stabil și, prin urmare, este utilizat pe scară largă în laboratoare.

2 、 Selecția tulpinii gazdă:

(1) BL21 este una dintre cele mai utilizate tulpini pentru expresia procariotă, care este potrivită în principal pentru expresia proteinelor non-toxice cu E. coli polimerază, astfel încât poate fi aplicată la expresia sistemelor procariotice folosind E. coli ARN polimerază, cum ar fi TAC sau TRC (de exemplu, plasmide PMal).

(2) BL21 (DE3) integrează gena ARN polimerază a fagului T7 în regiunea λ fag DE3 pe cromozomul tulpinii BL21, care poate exprima atât ARN polimeraza T7, cât și ARN polimerazei E. coli , și poate fi utilizat pentru expresia plasmidelor, cum ar fi seria PET, PGEX, PMAL, și așa.

3, Metode de purificare a proteinelor:

(1) Gel filtration chromatography: according to the molecular size from the mixture to separate proteins, the shape of different proteins and the molecular size of the differences in the mixture through the gel filtration chromatography column containing filler particles, due to the molecular size of various proteins are different, the diffusion into the specific size of the aperture particles of the ability to vary, the larger the protein molecules will be the Primul care va fi eluat din molecule sunt mai mici cu mai târziu, mai târziu eluția.

(2) Cromatografia de schimb de ioni: separarea și purificarea proteinelor se bazează pe diferitele sarcini de pe suprafața proteinei, suprafața proteinei este de obicei încărcată uniform și poate fi combinată cu coloane de schimb de cation/anion în anumite condiții. Când pH -ul este schimbat sau un tampon cu o rezistență ionică în creștere treptată este utilizată pentru eluție, substanța legată poate fi schimbată cu ionii din eluant și eluată în soluție. Deoarece diferite substanțe au sarcini diferite și abilități de legare diferite cu coloana de schimb de ioni, ordinea de a fi eluată în soluție este de asemenea diferită.

(3) Hydrophobic Chromatography: Using the hydrophobicity of proteins, hydrophobic residues will be exposed on the surface of proteins after denaturation or in a high salt environment, the hydrophobic residues of different proteins have different strengths of action with the hydrophobic ligands of the stationary phase, and hydrophobicity can be used as a weakest to strongest component separation by using the ionic strength of the eluent in order from high to scăzut.

(4) Cromatografie de afinitate: ligandul specific al unei proteine ​​care trebuie purificat (sau etichetat pe proteină) este atașat covalent la molecula purtătoare prin metode chimice adecvate. Atunci când amestecul de proteine ​​este adăugat la coloana cromatografică umplută cu mediu de afinitate, proteina care trebuie purificată este legată în mod specific de ligand, în timp ce celelalte proteine ​​nu sunt legate și îndepărtate prin spălare, iar proteina specifică legată poate fi eluată cu o soluție de ligand liber corespunzător. Proteinele legate specific pot fi eluate cu o soluție care conține ligandul corespunzător liber.

4 、 Selecția etichetelor de purificare a proteinelor:

Caracteristicile diferitelor etichete sunt următoarele țe

Purificarea tagului His: His-tag este una dintre cele mai utilizate etichete, unde se adaugă 6-10 histidină la terminalul amino sau carboxil al proteinei, iar proteina țintă este purificată prin capacitatea sa de a se lega strâns de coloane de chelare Ni2+ în condiții normale sau de denaturare (de exemplu, 8m uree) și apoi eluate cu fântâna de imidazol).

Reactivi de laborator:

Iptg; LB mediu;

Buffer de liză: 20 mM Tris (7,9), 500 mm NaCl, 10 mM imidazol;

Tampon de spălare: 20 mm Tris (7,9), 500 mm NaCl, 20 mM imidazol;

Buffer de eluție: 20mm Tris (7,9), 200 mm NaCl, 300mm imidazol ( concentrația de imidazol poate fi ajustată în funcție de eficiența eluției );

Soluție de dializă: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10% glicerol;

Soluție de colorare albastră strălucitoare Kaomas; Soluție de decolorare

Instrumente:

Ni-NTA, Breaker cu ultrasunete, coloană de cromatografie, tuburi de concentrare

1 、 Construcția plasmidei de expresie procariotă: PCR a genei țintă, digestie vectorială, ligare, transformare, alegând o singură clonă pentru secvențiere;

2 、 Transformați plasmida construită cu succes în BL21 (DE3), incubați la 37 ℃ peste noapte și alegeți clona unică pentru agitare mică peste noapte;

3 、 Inducție mică pentru a afla cele mai bune condiții de inducție: va fi zguduită peste noapte Soluția bacteriană 1: 1000 Inoculare în 3 ml lb, 37 ℃ Scuturând 4-5H la soluția bacteriană OD600 = 0,6-0,8, adăugați diferite concentrații de IPTG (0,1-1mm), diferite temperaturi, cu scăderea temperaturii, 30 ℃ este extinsă, cum ar fi 37 ℃ indus de temperatură 6H-8H indus de 16 ℃ 16-20H, 16 ° C indus 16-20H, temperatura este redusă, timpul este prelungit, cum ar fi 37 ℃ 4-5H, 30 ℃ indus de 6H-8H, 16 ° C, 16-20H, temperatura este redusă. C pentru 16-20H, luați seva bacteriană înainte și după inducție în diferite condiții de inducție, rulați gelul, pata și observați rezultatele inducției; (În general, cu atât este mai mică concentrația de IPTG și cu atât temperatura de inducție este mai mică, cu atât expresia proteinei țintă, cu atât mai favorabilă plierii corecte a proteinelor, crescând astfel solubilitatea lor și reducând generarea de corpuri de incluziune)

4 、 După ce ați găsit cele mai potrivite condiții de inducție, inoculați soluția bacteriană 1: 1000 în 2L de lb, se agită la 37 ℃ până la OD600 a soluției bacteriene = 0,6-0,8, aspirați 20µl din soluția bacteriană și lăsați-o să ruleze gelul (1), apoi induce expresia proteinei în condiții de inducție adecvate obținute în pre-conperiment, și și aspira și lăsați -l să ruleze gelul (2);

5 、 Îndepărtați lichidul bacterian indus, centrifugă la 4000g timp de 15 minute la 4 ℃;

6 、 Aruncați supernatantul, cântăriți, adăugați tampon de liză de 10 ml (1: 100 plus inhibitor de protează) pentru fiecare gram de bacterii, resuspend, așezați pe gheață pentru aproximativ 30 de minute;

7 、 Crizuarea presiunii: Îndepărtați alcoolul în omogenizatorul de înaltă presiune, clătiți cu apă de două ori, folosiți tampon de liză pentru a se echilibra o dată, adăugați lichidul bacterian, presurizarea (presiunea nu trebuie să depășească 800kpa), lichidul bacterian de trei până la cinci ori pentru a fi transparent și nu este lipicios;

8 、 Colectați lichidul bacterian zdrobit, 12000g, 4 ℃ centrifugare pentru 20min, supernatantul și separarea precipitată, fiecare probă de 20 µl reținută (3) (4) pentru a fi rulată gel;

9、2ml ni-NTA a fost adăugat la coloana de purificare, pentru a fi filtrată cu etanol, clătită cu apă și a adăugat tampon de liză pentru a echilibra coloana;

10 、 Cu resuspensionarea tamponului de liză Ni-NTA adăugată la supernatant, amestecați bine, 4 ℃ incubație de agitator pentru 2 ore;

11 、 Supernatantul a fost trecut prin coloană la 4 ° C și s -au colectat 20 µl de filtrat (5);

12 、 Spălați coloana cu tampon de spălare de 5 ml de 3 ori, colectați proba de filtrat 20 μL (6);

13 、 Adăugați tampon de eluție de 1 ml, incubați timp de 5 minute, colectați eluatul, repetați de 5 ori, colectați 5 ml de eluat în același tub, lăsați 20 µl de probă (7);

14 、 Au fost efectuate probele de proteine ​​individuale obținute pe parcursul experimentului, colorate cu albastru strălucitor caumas timp de 1 oră și decolorizate până când culoarea albastru de fundal a fost mai deschisă și benzile de proteine ​​clare au fost vizibile;

15 、 Analizați benzile de proteine ​​ale fiecărui eșantion, în funcție de rezultatele operației ulterioare: dacă proteinele eluate probe în proteină fără benzi heterozigote sau benzi heterozigote sau mai puțin și mai puțin, pot fi din nou dializă și concentrație, dacă mai multe benzi heterozigote trebuie să fie purificate din nou după dializă și concentrare.

16 、 Dializa: Adăugați eșantionul în membrana dializei, fixați ambele capete, dializa la 4 ℃ peste noapte;

17 、 Concentrația: în funcție de dimensiunea moleculară a greutății eșantionului pentru a alege tubul de concentrație corespunzător 4 ℃ concentrație de viteză mică, concentrația de măsurare a concentrației proteice, etichetarea, la înghețarea rapidă a azotului lichid și apoi înghețată în -80 ℃ frigider.

Figura de mai jos arată un grafic de kofection al purificării de afinitate a proteinei GFP in vitro, iar puritatea și concentrația proteinei purificate este mult crescută