Прочишћавање протеина    је процес увођења секвенци нуклеинске киселине који кодира протеине у ћелије домаћина, узрокујући да се изразе у великим количинама, а затим их прочишћавају ин витро користећи одговарајуће методе пречишћавања, а затим и принос и принос и принос . Системи експресије протеина могу се категорисати у прокариотске системе и ЕУКариотске системе.

Принципи и методе за индукцију експресије протеина у прокариотским системима и прочишћавање протеина ин витро користећи афинитетну хроматографију су описане у даљем тексту.

1, негативна регулација манипулатора лактозе:

У недостатку лактозе, лак манипулатор је у случају одвраћања, у то време и секвенца и изражава протејн за одвраћање лака да се веже за О секвенцу, спречавајући РНА полимеразу од везивања за подвијањем на позицију на ПЛОВЦЕНЦИЈУ. Када је присутна лактоза, лактоза улази у ћелију и катализује је β-галактосидаза и претворена у изолактила, која се везује за инхибиторски протеин, што је изазвао конформациону промјену у протеину и доводе до дисоцијације инхибитора протеина из секвенције.

Изопропилтиоогалацтосид (ИПТГ) делује на исти начин као и изогалацтоза и изузетно је снажан индуктор који се бактерија не метаболишу и је веома стабилан и стога се широко користи у лабораторијама.

2 Одабир соја домаћина:

(1) БЛ21 је један од најчешће коришћених сојева за прокариотско изражавање, који је углавном погодан за изражавање нетоксичних протеина са Е. цоли полимеразом, тако да се може применити на експресију прокариотских система помоћу Е. цоли РНА полимеразе као што је ТАЦ или ТРЦ (нпр. ПГЕКС, пАМАЛ ПАМАЛС).

(2) БЛ21 (ДЕ3) Интегрише ген Т7 Пхаге РНА полимеразе у региону Пхаге Де3 на хромозома од БЛ21, који може да изрази и Т7 РНА полимеразу и Е. цоли РНА полимеразу и може се користити за изражавање плазмида, као што је ПЛАМС, као што су ПЛАЧ, као што су ПЕТ серија, ПГЕКС, ПМАЛ и тако даље.

3, методе прочишћавања протеина:

(1) хроматографија за филтрирање гела: према молекуларном величини од смеше до одвојених протеина, облик различитих протеина и молекуларне величине разлика у боји филтра за филтрацију, који садржи честице за пуњење, због молекуларне величине различитих протеина, а дифузија у специфичној величини честица бленде, то ће бити веће молекуле протеина Прво је елуиран из молекула, касније су касније о томе касније.

(2) ИОН-ова хроматографија: Одвајање протеина и пречишћавање заснован је на различитим трошковима на површини протеина, површина протеина је обично једнолично набијена и може се комбиновати са ЦАТИОН / Анион Екцханге ступца под одређеним условима. Када се пХ промени или је тампон са постепено повећањем јонске снаге користи се за елуцију, везана супстанца може се заменити са јонима у елуент-у и елуирани у решење. Будући да различите супстанце имају различите трошкове и различите обавезујуће способности са колоном Ион Екцханге, редослед елуираног у раствор је такође различит.

(3) хидрофобна хроматографија: Коришћење хидрофобности протеина, хидрофобни остаци ће бити изложени на површини протеина након денатурације или у високом соли, хидрофобни остаци различитих протеина, а хидрофобичност се може користити као најслабија и хидрофобичност се може користити као најслабије од раздвајања елуента, а хидрофобичност се може користити као најслабија за најјачи део компонентног раздвајања. од високог до ниског.

(4) Афинитетна хроматографија: Специфични лиганд протеина који се пречисти (или означен на протеину) је ковалентно причвршћен на молекул носача одговарајућим хемијским методама. Када се смеша протеина дода у хроматографску колону испуњену средњом афинитетом, протеин који се пречисти је посебно везан за лиганд, док други протеини нису везани и уклањајући се прањем, а посебно везан протеин може се елуирати раствором бесплатног одговарајућег лиганда. Конкретно везане протеине могу се елуирати са раствором који садржи бесплатан одговарајући лиганд.

4, избор налепница за прочишћавање протеина:

Карактеристике различитих налепница су следеће ↓

Пречишћавање његових ознака: Његова ознака је једна од најчешће коришћених ознака, где се додаје 6-10 хистидина протеина, а циљани протеин је пречишћен могућом могућношћу да се чврсто везује на ни2 + хелантне ступце у нормалним или деманирајућим условима (нпр. 8М уреа), а затим се елуира са имидазолом (нпр. 8М уреа), а затим се елуира са имидазолом (нпр.

Лабораторијски реагенси:

ИПТГ; ЛБ Медиум;

Вафер за лизу: 20 мм Трис (7.9), 500 мм НаЦл, 10 мм имидазола;

Пуфер за прање: 20 мм Трис (7.9), 500 мм НаЦл, 20 мм имидазол;

Буффер за елузију: 20 мм Трис (7.9), 200 мм НаЦл, 300 мм имидазол ( концентрација имидазола може се подесити у складу са ефикасношћу елуције );

Диалисис решење: 20 мм Трис (7.9), 50 мМ НаЦл, 10% глицерол;

Замисно раствор боји бојило које је било сјајно плавим бојама; Решење за деколорисање

Инструменти:

НИ-НТА, ултразвучни прекидач, колона хроматографије, цонцентрацијске цеви

1, Изградња прокариотског израза плазмида: ПЦР циљни ген, векторски варење, лигација, трансформација, брање појединачног клон за секвенцирање;

2, трансформишите успешно изграђену плазмид у БЛ21 (ДЕ3), инкубирајте на 37 ℃ преко ноћи и одаберите један клон за мало тресење преко ноћи;

3, мала индукција да бисте сазнали најбоље индукционе услове: биће протресено раствор преко ноћи 1: 1000 Инокулација у 3МЛ ЛБ 4-5Х на бактерије од ОД600 = 0.6-0.8, додајте различите концентрације ИПТГ-а (0,1 мммм), са спуштањем температуре, као што је продужено време индукције 4-5х, 30 ℃. 6х-8х, 16 ℃ изазвано 16-20х, 16 ° Ц изазвано 16-20х, температура је смањена, време је продужено, као што је 37 ℃ изазвано 4-5х, 30 ℃ индуковано 6Х-8Х-8Х-8Х, 16 ° Ц индуковано 16-20х, температура је смањена. Ц за 16-20х, узмите бактеријски сок пре и после индукције у различитим условима индукције, покрените гел, мрље и посматрајте резултате индукције; (Генерално гледано, нижа концентрација ИПТГ-а и нижа индукциона температура, спори израз циљног протеина, што је погодније на исправно пресавијање протеина, чиме се повећава њихова растворљивост и смањују генерацију организованих тела)

4, након проналаска најприкладнијих услова индукције, инокулирајући бактеријско раствор 1: 1000 у 2Л ЛБ, протресите на 37 ℃ До од 600 бактеријалног раствора = 0.6-0.8, аспирирајући 20 μл раствора бактерије и оставите да покрене гел (1), а затим изазвате протеинским условима у прецизирању и аспирације је и аспирирајући га у прецизирању и аспират је. да покрене гел (2);

5, уклоните индуковану бактеријску течност, центрифугу на 4000 г за 15мин на 4 ℃;

6, одбаците супернатант, вагати, додајте 10 мл пуфера за лизу (1: 100 плус инхибитор протеазе) за сваки грам бактерија, ресуспенда, место на леду за око 30 мин;

7, дробљење притиска: Одложите алкохол у хомогенизатор високог притиска, исперите водом два пута, додајте бактеријску течност, додајте бактеријску течност, притисак (притисак не сме прелазити 800кПа), бактеријска течност на транспарентну и не лепљиви;

8, прикупљају здробљену бактеријску течност, 12000 г, 4 ℃ центрифугирање за 20 мин, одвајање супернатантне и талог, свака је задржала узорак од 20 ул (3) (4) да се води гел;

9,2мл Ни-НТА је додат у колону за пречишћавање, да је филтриран етанолом, испран водом и дода се пуфер за лизу да бисте је урадио у циљу равнотеже;

10, са пуфером за лизу НИ-НТА ресуспензија додата супернатант, добро измешајте, 4 ℃ Схакер Инкубација за 2Х;

11, супернатант је прошао кроз колону на 4 ° Ц, а прикупљено је 20 ул филтрата (5);

12, оперите колону са 5 мл пуфером за прање 3 пута, прикупите узорак филтрата 20 уЛ (6);

13, додајте 1МЛ пуфер за испирање, инкубирајте за 5мин, прикупите елуате, поновите 5 пута, прикупите 5 мл елуате-а у истој цеви, оставите 20 ул узорка (7);

14, појединачни узорци протеина добијени током експеримента су се покренули, обојени са цаумас сјајним плавим плавим за 1х, и деколорисани све док позадинску плаву боју није била лакша и бистри протеински бендови били видљиви;

15, Анализирајте протеинске бендове сваког узорка, у складу са резултатима накнадног рада: ако су елуирани узорци протеина у протеину без хетерозиготних трака или хетерозиготних трака или мање и плитки, могу бити дијализи и концентрације, ако се више хетерозиготних бендова мора поново пречистити након дијализе и концентрације.

16, дијалисис: Додајте узорак у дијализни мембрану, стезање и на крају, дијализу на 4 ℃ преко ноћи;

17, концентрација: Према величини молекуларне тежине узора да одабере одговарајућу концентрациону цев 4 ℃ концентрација нижег брзине, концентрација концентрације протеина, етикетирање, у течном азоту брзо-смрзавање, а затим замрзнути у -80 ℃ фрижидера.

Слика у наставку приказује кофекцијски парцели за пречишћавање афинитета гфп протеина ин витро, а чистоћа и концентрација прочишћеног протеина је увелико повећана