Очистка белков    — это процесс введения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки, в клетки-хозяева с помощью методов генной инженерии, вызывая их экспрессию в больших количествах, а затем очищая их in vitro с использованием соответствующих методов очистки с целью получения белков высокой чистоты, активности и выхода . Системы экспрессии белков можно разделить на прокариотические системы и эукариотические системы..

принципы и методы индукции экспрессии белков в прокариотических системах и очистки белков in vitro с использованием аффинной хроматографии . Ниже описаны

1. Негативная регуляция лактозного манипулятора:

В отсутствие лактозы lac-манипулятор находится в состоянии сдерживания, когда последовательность I экспрессирует сдерживающий белок Lac для связывания с последовательностью O, предотвращая связывание РНК-полимеразы с последовательностью P и ингибируя инициацию транскрипции. Когда присутствует лактоза, лактоза проникает в клетку и катализируется β-галактозидазой и превращается в изолактозу, которая связывается с ингибирующим белком, вызывая конформационные изменения в белке и приводя к диссоциации ингибирующего белка от О-последовательности, тем самым инициируя транскрипцию.

Изопропилтиогалактозид (ИПТГ) действует так же, как изогалактоза, и является чрезвычайно мощным индуктором, не метаболизируется бактериями и очень стабилен, поэтому широко используется в лабораториях.

2. Выбор штамма-хозяина:

(1) BL21 является одним из наиболее часто используемых штаммов для прокариотической экспрессии, который в основном подходит для экспрессии нетоксичных белков с помощью полимеразы E. coli, поэтому его можно применять для экспрессии прокариотических систем с использованием РНК-полимеразы E. coli, такой как tac или trc (например, плазмиды pGEX, pMAL).

(2) BL21(DE3) интегрирует ген РНК-полимеразы фага T7 в область DE3 фага λ на хромосоме штамма BL21, который может экспрессировать как РНК-полимеразу T7, так и РНК-полимеразу E. coli , и может использоваться для экспрессии плазмид, таких как серия pET, pGEX, pMAL и так далее.

3, методы очистки белка:

(1) Гель-фильтрационная хроматография: в зависимости от размера молекул смеси для отдельных белков, формы различных белков и молекулярных размеров различий в смеси через колонку гель-фильтрационной хроматографии, содержащую частицы наполнителя, из-за того, что размер молекул различных белков различен, диффузия в конкретный размер апертурных частиц может варьироваться, тем больше молекулы белка будут первыми, которые будут элюированы из молекул, чем меньше, тем позже элюирование.

(2) Ионообменная хроматография: разделение и очистка белков основаны на различных зарядах на поверхности белка, поверхность белка обычно заряжена равномерно, и при определенных условиях ее можно комбинировать с катионообменными/анионообменными колонками. Когда изменяется pH или для элюирования используется буфер с постепенно увеличивающейся ионной силой, связанное вещество может обмениваться с ионами в элюенте и элюироваться в раствор. Поскольку разные вещества имеют разные заряды и разную способность связывания с ионообменной колонкой, порядок элюирования в раствор также различен.

(3) Гидрофобная хроматография: используя гидрофобность белков, гидрофобные остатки будут обнажены на поверхности белков после денатурации или в среде с высоким содержанием соли, гидрофобные остатки разных белков имеют разную силу действия с гидрофобными лигандами неподвижной фазы, а гидрофобность можно использовать для разделения компонентов от самого слабого до самого сильного, используя ионную силу элюента в порядке от высокой к низкой.

(4) Аффинная хроматография: специфический лиганд белка, который необходимо очистить (или пометить на белке), ковалентно присоединяется к молекуле-носителю с помощью соответствующих химических методов. При добавлении смеси белков в хроматографическую колонку, заполненную аффинной средой, очищаемый белок специфически связывается с лигандом, в то время как другие белки не связываются и удаляются промыванием, а специфически связанный белок может быть элюирован раствором свободного соответствующего лиганда. Специально связанные белки можно элюировать раствором, содержащим свободный соответствующий лиганд.

4. Выбор этикеток для очистки белка:

Характеристики различных этикеток следующие↓

Очистка His-меткой: His-tag является одной из наиболее часто используемых меток, при которой 6-10 гистидина добавляются к амино- или карбоксильному концу белка, а целевой белок очищается за счет его способности прочно связываться с Ni2+-хелатными колонками в нормальных или денатурирующих условиях (например, 8M мочевина), а затем элюируется имидазолом (который конкурирует за связывание с ионами никеля в лунках с шариками).

Лабораторные реагенты:

ИПТГ; LB средний;

Лизисный буфер: 20 мМ Трис (7,9), 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола;

Промывочный буфер: 20 мМ Трис (7,9), 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола;

Буфер для элюирования: 20 мМ Трис (7,9), 200 мМ NaCl, 300 мМ имидазола ( концентрацию имидазола можно регулировать в зависимости от эффективности элюирования );

Диализный раствор: 20 мМ Трис (7,9), 50 мМ NaCl, 10% глицерин;

Красящий раствор Kaomas Brilliant Blue; обесцвечивающий раствор

Инструменты:

Ni-NTA, ультразвуковой дробитель, хроматографическая колонка, концентрационные пробирки

1. Конструирование прокариотической экспрессирующей плазмиды: ПЦР целевого гена, векторное расщепление, лигирование, трансформация, отбор одного клона для секвенирования;

2、Трансформируйте успешно сконструированную плазмиду в BL21(DE3), инкубируйте при 37℃ в течение ночи и отберите одиночный клон для небольшого встряхивания в течение ночи;

3. Небольшая индукция для определения наилучших условий индукции: будет встряхиваться на ночь бактериальный раствор 1:1000, инокуляция в 3 мл LB, 37 ℃ встряхивание в течение 4-5 часов до бактериального раствора OD600 = 0,6-0,8, добавление различных концентраций IPTG (0,1-1 мМ), разные температуры, с понижением температуры время индукции увеличивается, например 37 ℃ индуцируется 4–5 часов, 30 ℃ индуцируется 6–8 часов, 16 ℃ индуцируется 16–20 часов, 16 ° C индуцируется 16–20 часов, температура снижается, время увеличивается, например, 37 ℃ индуцируется 4–5 часов, 30 ℃ индуцируется 6–8 часов, 16 ° C индуцируется 16–20 часов, температура снижается. C в течение 16-20 часов, возьмите бактериальный сок до и после индукции в различных условиях индукции, прогоните гель, окрасьте и наблюдайте за результатами индукции; (Вообще говоря, чем ниже концентрация IPTG и чем ниже температура индукции, тем медленнее экспрессия целевого белка, тем больше способствует правильному сворачиванию белков, тем самым увеличивая их растворимость и уменьшая образование телец включения)

4. После нахождения наиболее подходящих условий индукции инокулируйте бактериальный раствор 1:1000 в 2 л LB, встряхивайте при 37 ℃ до тех пор, пока OD600 бактериального раствора не будет = 0,6-0,8, аспирируйте 20 мкл бактериального раствора и оставьте его для работы геля (1), затем индуцируйте экспрессию белка в подходящих условиях индукции, полученных в предварительном эксперименте, и аспирируйте 20 мкл бактериального раствора и дайте ему стечь гелю (2);

5. Удалите индуцированную бактериальную жидкость, центрифугируйте при 4000 г в течение 15 минут при 4 ℃;

6. Отбросьте супернатант, взвесьте, добавьте 10 мл лизирующего буфера (1:100 плюс ингибитор протеазы) на каждый грамм бактерий, ресуспендируйте, поместите на лед примерно на 30 минут;

7. Дробление под давлением: вылейте спирт в гомогенизатор высокого давления, дважды промойте водой, один раз используйте лизисный буфер для балансировки, добавьте бактериальную жидкость, настройте давление (давление не должно превышать 800 кПа), бактериальную жидкость более трех-пяти раз, чтобы она была прозрачной и не липкой;

8. Соберите измельченную бактериальную жидкость, 12000 г, центрифугирование при 4 ℃ в течение 20 минут, разделение надосадочной жидкости и осадка, каждый оставленный образец по 20 мкл (3) (4) для анализа геля;

В колонку для очистки добавляли 9,2 мл Ni-NTA, фильтровали в этаноле, промывали водой и добавляли лизирующий буфер для уравновешивания колонки;

10. К супернатанту добавлен лизирующий буфер Ni-NTA, хорошо перемешать, инкубировать на шейкере при 4 ℃ в течение 2 часов;

11. Супернатант пропускали через колонку при 4°C и собирали 20 мкл фильтрата (5);

12. Промойте колонку 5 мл промывочного буфера 3 раза, соберите 20 мкл образца фильтрата (6);

13. Добавьте 1 мл элюирующего буфера, инкубируйте 5 минут, соберите элюат, повторите 5 раз, соберите 5 мл элюата в ту же пробирку, оставьте 20 мкл образца (7);

14. Отдельные образцы белка, полученные в ходе эксперимента, обрабатывали, окрашивали бриллиантовым синим Каумаса в течение 1 часа и обесцвечивали до тех пор, пока синий цвет фона не стал светлее и не стали видны четкие полосы белка;

15、Анализируйте белковые полосы каждого образца в соответствии с результатами последующей операции: если элюированные образцы белка в белке без гетерозиготных полос или гетерозиготных полос или меньше и неглубоки, могут быть подвергнуты диализу и концентрации, если больше гетерозиготных полос необходимо снова очистить после диализа и концентрирования.

16. Диализ: добавьте образец в диализную мембрану, зажмите оба конца, диализ при 4 ℃ в течение ночи;

17. Концентрация: в зависимости от размера молекулярной массы образца выберите подходящую концентрационную пробирку. 4 ℃ низкоскоростная концентрация, концентрация измерения концентрации белка, маркировка, быстрая заморозка жидким азотом, а затем замораживание в холодильнике -80 ℃.

На рисунке ниже показан график кофекции аффинной очистки белка GFP in vitro, при этом чистота и концентрация очищенного белка значительно увеличиваются.