Очистка белка    - это процесс введения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки в клетки -хозяева с помощью методов генной инженерии, вызывая их экспрессируемые в больших количествах, а затем очищают их in vitro, используя соответствующие методы очистки для получения белков с высокой чистотой, активностью и урожаем . Системы экспрессии белка могут быть классифицированы на прокариотические системы и эукариотические системы.

Принципы и методы индукции экспрессии белка в прокариотических системах и очищающих белках in vitro с использованием аффинной хроматографии описаны ниже.

1 、 Отрицательная регуляция манипулятора лактозы:

При отсутствии лактозы лак -манипулятор находится в состоянии сдерживания, в то время, когда I -последовательность экспрессирует белок сдерживания LAC, связывающегося с O -последовательности, предотвращая связывание РНК -полимеразы с P -последовательностью и ингибируя инициацию транскрипции. Когда присутствует лактоза, лактоза попадает в клетку и катализируется β-галактозидазой и преобразуется в изолактозу, что связывается с ингибирующим белком, вызывая конформационное изменение белка и приводит к диссоциации ингибирующего белка из последовательности O, тем самым инициирующий транскрипцию.

Изопропилтиогалактозид (IPTG) действует так же, как изогалактоза и является чрезвычайно мощным индуктором, который не метаболизируется бактериями и является очень стабильным и, следовательно, широко используется в лабораториях.

2 、 Выбор деформации хоста:

(1) BL21 является одним из наиболее часто используемых штаммов для прокариотической экспрессии, которая в основном подходит для экспрессии нетоксических белков с помощью полимеразы E. coli, поэтому его можно применить к экспрессии прокариотических систем с использованием РНК-полимеразы E. coli, такой как TAC или TRC (EG PGEX, PMAL-плазмиды).

(2) BL21 (DE3) интегрирует ген полимеразы Phage Phage T7 в области λ -фага DE3 на хромосоме штамма BL21, которая может экспрессировать как РНК -полимеразу T7, так и РНК -полимеразу E. coli , и может использоваться для экспрессии плазмид, таких как серия ПЭТ, PGEX, PMAL и так.

3, Методы очистки белка:

(1) Гель -фильтрационная хроматография: в соответствии с размером молекулярного размера от смеси до отдельных белков, форма различных белков и молекулярные размеры различий в смеси через гель -фильтрационную хроматографию, содержащую частицы наполнителя, из -за молекулярных размеров различных белков различны, диффузии в специфическую размер частиц в апертизациях, которые будут расти, растягивается, что все большее, что будет больше, будет больше, чтобы быть большим, что нарастает, что будет больше, чтобы быть большим, что в целевое, что будет больше видно, будет больше, что в целом. Элюируемые из молекул меньше, чем более позднее элюирование.

(2) Ионообменная хроматография: разделение и очистка белка основаны на различных зарядах на поверхности белка, поверхность белка обычно заряжается равномерно и может объединяться с катионо -анионными обменными колонками при определенных условиях. Когда pH изменяется, или буфер с постепенно увеличивающейся ионной силой используется для элюирования, связанное вещество можно обмениваться с ионами в элюенте и элюируется в растворе. Поскольку разные вещества имеют разные заряды и различные способности связывания с столбцом ионообменного обмена, порядок элюировки в решение также отличается.

(3) Hydrophobic Chromatography: Using the hydrophobicity of proteins, hydrophobic residues will be exposed on the surface of proteins after denaturation or in a high salt environment, the hydrophobic residues of different proteins have different strengths of action with the hydrophobic ligands of the stationary phase, and hydrophobicity can be used as a weakest to strongest component separation by using the ionic strength of the eluent in order from high to низкий.

(4) Аффинная хроматография: специфический лиганд белка, который очищен (или метит на белке), ковалентно прикреплен к молекуле носителя соответствующими химическими методами. Когда белковая смесь добавляется в хроматографическую колонну, заполненную аффинной средой, очищенный белок специфически связан с лигандом, в то время как другие белки не связаны и удаляются промывками, а специфически связанный белок может элюироваться с раствором свободного соответствующего лиганда. Специально связанные белки могут быть элюированы раствором, содержащим свободный соответствующий лиганд.

4 、 Выбор меток очистки белка:

Характеристики разных метков следующие ↓

Очистка HIS-TAG: HIS-TAG является одной из наиболее часто используемых тегов, где 6-10 гистидин добавляется к амино или карбоксильному концу белка, а целевой белок очищается его способностью тесно связываться с Ni2+ хелатирующими колонками в нормальных или денатуальных условиях (EG, мочевина 8 м), а затем элюируется имидазоли (что соревнуются в стиле).

Лабораторные реагенты:

IPTG; LB Средний;

Буфер для лизиса: 20 мм трис (7,9), 500 мм NaCl, 10 мм имидазол;

Промытый буфер: 20 мм Трис (7,9), 500 мм NaCl, 20 мм имидазол;

Буфер элюции: 20 мм Трис (7,9), 200 мм NaCl, 300 мм имидазол ( концентрация имидазола может быть скорректирована в соответствии с эффективностью элюирования );

Раствор диализа: 20 мм Трис (7,9), 50 мм NaCl, 10% глицерин;

Каомас блестящий синий окрашивание; Обедоолооризирующий решение

Инструменты:

Ni-NTA, Ultrasonic Breaker, хроматографическая колонка, концентрационные трубки

1 、 Конструирование прокариотической экспрессии плазмиды: ПЦР гена -мишени, векторное пищеварение, лигирование, трансформация, выбор одиночного клона для секвенирования;

2 、 Преобразование успешно построенной плазмиды в BL21 (DE3), инкубируйте при 37 ℃ в течение ночи и выберите один клон для небольшого встряхивания в течение ночи;

3 、 Небольшая индукция, чтобы выяснить наилучшие условия индукции: будут встряхиваться в течение ночи бактериального раствора 1: 1000 инокуляции в 3 мл фунта, 37 ℃ встряхивая 4-5H к бактериальному раствору od600 = 0,6-0,8, добавьте различные концентрации IPTG (0,1-1 мм), различные температуры, с понижением температуры, индикации, индикации, 37, 37, 37-й. Индуцированные 6H-8H, 16-20H, индуцированные 16-20H, 16 ° C, индуцировали 16-20 часов, температура снижается, время продлевается, например, 37 ℃ индуцируется 4-5H, 30 ℃ индуцируется 6H-8H, индуцируется 16-20H, температура снижается. C В течение 16-20 часов возьмите бактериальный сок до и после индукции в различных условиях индукции, запустите гель, окрашивайте и наблюдайте за результатами индукции; (Вообще говоря, чем ниже концентрация IPTG и чем ниже температуру индукции, чем медленнее экспрессия целевого белка, тем более способствующим правильным складыванию белков, тем самым увеличивая их растворимость и снижая генерацию включенных тел)

4 、 После обнаружения наиболее подходящих условий индукции инокулируйте бактериальный раствор 1: 1000 в 2 л фунта, встряхнуте при 37 ℃ до тех пор, пока OD600 бактериального раствора = 0,6-0,8, астмата 20 мкл бактериального раствора и оставляет его для выполнения геля (1), а затем индуцируют экспрессию белка при подходящем индусном условиях, полученном в предварительном иелете, а также в асиморе, а также в асиморе, и призрачном, и призрачном растворе, и призрачном растворе, и призрачного раствора, и призрачного раствора, а также призрачного раствора, а также для принудительного раствора, а также в принудительном растворе, а также в принудительном растворе, а также в приличительном растворе и в принудительном растворе, а также в принудительном растворе-и призрачном и оставьте его, чтобы запустить гель (2);

5 、 Удалить индуцированную бактериальную жидкость, центрифуга при 4000 г в течение 15 минут при 4 ℃;

6 、 Откажитесь от супернатанта, взвешивайте, добавьте 10 мл буфера для лизиса (1: 100 плюс ингибитор протеазы) для каждого грамма бактерий, ресуспенда, место на льду около 30 минут;

7 、 Разрушение давления: отложите спирт в гомогенизатор высокого давления, дважды промойте водой, используйте буфер лизиса, чтобы сбалансировать один раз, добавить бактериальную жидкость, давление (давление не должно превышать 800 кПа), бактериальная жидкость в течение трех-пяти раз для прозрачной и не липкой;

8 、 Соберите измельченную бактериальную жидкость, 12000 г, 4 ℃ центрифугирование в течение 20 минут, супернатант и разделение осадков, каждый из которых сохранял 20 мкл образца (3) (4) для запуска геля;

9–2 мл Ni-NTA добавляли в колонку очищения, чтобы быть отфильтрованным этанолом, промыта водой и добавил буфер для лизиса для уравновешивания колонки;

10 、 с лизисным буфером ni-nta resuspension, добавленным в супернатант, хорошо смешайте, 4 ℃ инкубация шейкера в течение 2 часов;

11 、 Супернатант проходил через колонку при 4 ° С и собирали 20 мкл фильтрата (5);

12 、 промыть колонку 5 мл промывочного буфера 3 раза, собрать образец фильтрата 20 мкл (6);

13 、 Добавьте 1 мл буфера элюирования, инкубируйте в течение 5 минут, собирайте элюат, повторите 5 раз, собирайте 5 мл элюата в той же трубе, оставьте 20 мкл образца (7);

14 、 Индивидуальные образцы белка, полученные в ходе эксперимента, были проведены, окрашены камусом блестящим синим цветом в течение 1 часа, и деколорировали до тех пор, пока фоновый синий цвет не стал более легким, а прозрачные белковые полосы не были видны;

15 、 Проанализируйте белковые полосы каждого образца, в соответствии с результатами последующей операции: если образцы элюированного белка в белке без гетерозиготных полос или гетерозиготных полос или меньше и мелкие, могут быть диализом и концентрацией, если больше гетерозиготных полос необходимо снова очистить после диализа и концентрации.

16 、 Диализ: добавьте образец в мембрану диализа, зажимайте оба конца, диализ при 4 ℃ в течение ночи;

17 、 Концентрация: в соответствии с размером молекулярной массы образца, чтобы выбрать подходящую концентрационную трубку 4 ℃ низкоскоростной концентрации, концентрация измерения концентрации белка, маркировка, в быстрорезащите жидкости, а затем заморожен в -80 ℃ холодильником.

На рисунке ниже показан график кофекции с аффинной очисткой белка GFP in vitro, а чистота и концентрация очищенного белка значительно увеличиваются