Protein saflaştırması,    genetik mühendislik teknikleri aracılığıyla proteinleri konakçı hücrelere kodlayan nükleik asit sekanslarının sokulması, büyük miktarlarda eksprese edilmesine neden olma ve daha sonra yüksek saflık, aktivite ve verim proteinlerini elde etmek için uygun arıtma yöntemlerini kullanarak in vitro olarak saflaştırma işlemidir . Protein ekspresyon sistemleri olarak kategorize edilebilir prokaryotik sistemler ve ökaryotik sistemler .

indükleme prensipleri ve yöntemleri Prokaryotik sistemlerde protein ekspresyonunu indükleme ve afinite kromatografisi kullanılarak in vitro arınma proteinleri aşağıda açıklanmaktadır.

1 、 Laktoz manipülatörünün negatif düzenlemesi:

Laktoz yokluğunda, LAC manipülatör bir caydırıcılık durumundadır, bu sırada I dizisi, O dizisine bağlanacak LAC caydırıcı proteini eksprese ederek RNA polimerazın P sekansına bağlanmasını ve transkripsiyon başlangıcını inhibe etmesini önler. Laktoz mevcut olduğunda, laktoz hücreye girer ve β-galaktosidaz ile katalize edilir ve inhibitör proteine ​​bağlanan, proteinde konformasyonel bir değişikliğe neden olan ve o sekansından inhibitör proteinin ayrılmasına yol açan ve böylece transkripsiyona yol açan izolaktoza dönüştürülür.

İzopropilthiogalaktosid (IPTG) izogalaktozla aynı şekilde hareket eder ve bakteriler tarafından metabolize olmayan ve çok kararlı olan ve bu nedenle laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan son derece güçlü bir indükleyicidir.

2 、 Konak gerilim seçimi:

(1) BL21, esas olarak E. coli polimeraz ile ekspresyonu için uygun olan prokaryotik ekspresyon için en yaygın kullanılan suşlardan biridir, toksik olmayan proteinlerin bu nedenle TAC veya TRC gibi E. coli RNA polimeraz (EG pGex, pmal plazmidler) kullanılarak prokaryotik sistemlerin ekspresyonuna uygulanabilir.

(2) BL21 (DE3), T7 faj RNA polimeraz genini, hem T7 RNA polimeraz hem de E. coli RNA polimerazını eksprese edebilen ve PET serileri, PGEx, pmal vb.

3, protein saflaştırma yöntemleri:

(1) Gel filtration chromatography: according to the molecular size from the mixture to separate proteins, the shape of different proteins and the molecular size of the differences in the mixture through the gel filtration chromatography column containing filler particles, due to the molecular size of various proteins are different, the diffusion into the specific size of the aperture particles of the ability to vary, the larger the protein molecules will be the first to daha sonra elüsyon daha sonra moleküllerden daha küçük.

(2) İyon değişim kromatografisi: Protein ayrımı ve saflaştırma, proteinin yüzeyindeki farklı yüklere dayanır, proteinin yüzeyi genellikle düzgün bir şekilde yüklenir ve belirli koşullar altında katyon/anyon değişim kolonları ile birleştirilebilir. PH değiştirildiğinde veya elüsyon için kademeli olarak artan iyonik mukavemet olan bir tampon kullanıldığında, bağlı madde eluent içindeki iyonlarla değiştirilebilir ve çözeltiye elüte edilebilir. Farklı maddeler, iyon değişim sütunu ile farklı yüklere ve farklı bağlanma yeteneklerine sahip olduğundan, çözeltiye elüte olma sırası da farklıdır.

(3) Hidrofobik Kromatografi: Proteinlerin hidrofobikliğini kullanarak, hidrofobik tortular denatürasyondan sonra veya yüksek tuz ortamında proteinlerin yüzeyine maruz kalacak, farklı proteinlerin hidrofobik kalıntıları, istasyonlu fazın hidrofobik ligandları ile hidrofobik ligandlar ile, hidrofobikliğin nesli basılı mukavemetiyle, netin en yüksek şekilde kullanılabilir. Düşük.

(4) Affinite Kromatografisi: Saflaştırılacak (veya protein üzerinde etiketlenecek) bir proteinin spesifik ligandı, uygun kimyasal yöntemlerle taşıyıcı molekülüne kovalent olarak bağlanır. Protein karışımı afinite ortamı ile doldurulmuş kromatografik kolona ilave edildiğinde, saflaştırılacak protein spesifik olarak liganda bağlanırken, diğer proteinler yıkanarak bağlanmaz ve çıkarılır ve spesifik olarak bağlı protein, serbest karşılık gelen ligand çözeltisi ile elüte edilebilir. Spesifik olarak bağlı proteinler, serbest karşılık gelen ligandı içeren bir çözelti ile elüte edilebilir.

4 、 Protein Saflaştırma Etiketlerinin Seçimi:

Farklı etiketlerin özellikleri aşağıdaki gibidir.

HIS-TAG Saflaştırma: His-TAG, proteinin amino veya karboksil terminaline 6-10 histidin ilave edildiği ve hedef protein, normal veya denatüre edici koşullar altında (örneğin, 8M ürea) (örneğin, 8M üre) elüde olan (örneğin, 8M Urea) elüde olan Ni2+ şelalasyon kolonlarına eklenir.

Laboratuvar Reaktifleri:

IPTG; LB ortamı;

Liziz tamponu: 20 mm Tris (7.9), 500 mm NaCl, 10 mM imidazol;

Yıkama tamponu: 20 mm Tris (7.9), 500 mm NaCl, 20 mm imidazol;

Elüsyon tamponu: 20mm Tris (7.9), 200mm NaCl, 300mm imidazol ( imidazol konsantrasyonu elüsyon verimliliğine göre ayarlanabilir );

Diyaliz çözeltisi: 20 mM Tris (7.9), 50 mM NaCl,% 10 gliserol;

Kaomalar parlak mavi boyama çözeltisi; Çökdürücü Çözüm

Enstrümanlar:

Ni-NTA, ultrasonik kesici, kromatografi sütunu, konsantrasyon tüpleri

1 、 Prokaryotik ekspresyon plazmidinin yapımı: hedef gen PCR, vektör sindirimi, ligasyon, dönüşüm, sekanslama için tek klon toplama;

2 、 Başarılı bir şekilde yapılandırılmış plazmid BL21'e (DE3) dönüştürün, gece boyunca 37 ℃ inkübe edin ve gece boyunca küçük sallama için tek klonu seçin;

3、Small induction to find out the best induction conditions: will be shaken overnight bacterial solution 1:1000 inoculation into 3mL LB, 37 ℃ shaking 4-5h to the bacterial solution OD600 = 0.6-0.8, add different concentrations of IPTG (0.1-1mM), different temperatures, with the lowering of the temperature, induction time is extended, such as 37 ℃ induced 4-5h, 30 ℃ İndüklenen 6H-8H, 16 ℃ indüklenen 16-20H, 16 ° C indüklenen 16-20H, sıcaklık azalır, zaman uzatılır, örneğin 37 ℃ indüklenen 4-5H, 30 ℃ indüklenen 6H-8H, 16 ° C indüklenen 16-20H, sıcaklık azalır. C 16-20h için, farklı indüksiyon koşulları altında indüksiyondan önce ve sonra bakteriyel özsu alın, jeli çalıştırın, leke ve indüksiyon sonuçlarını gözlemleyin; (Genel olarak, IPTG konsantrasyonu ne kadar düşük olursa ve indüksiyon sıcaklığı ne kadar düşük olursa, hedef proteinin ekspresyonu ne kadar yavaş olursa, proteinlerin doğru katlanmasına o kadar elverişli olur, böylece çözünürlüklerini arttırır ve inklüzyon cisimlerinin oluşumunu azaltır)

4 、 En uygun indüksiyon koşullarını bulduktan sonra, bakteriyel çözeltiyi 1: 1000'e 2L'ye aşılayın, bakteriyel çözeltinin OD600'üne kadar 37 ℃'de sallanın = 0.6-0.8, bakteri çözeltisinin 20μl'sine kadar, jel (1) 'de çalıştırılan uygun indüksiyon koşulları altında protein ekspresyonunu indükleme ve daha sonra protein ekspresyonunu indükleme ve daha sonra protein ekspresyonunu indükleme ve ve jeli çalıştırmak için bırakın (2);

5 、 İndüklenen bakteriyel sıvıyı çıkarın, 4000g'de 4000g'de 4 ℃ 'de santrifüj;

6 、 Supernatant atın, tartın, her bir bakteri gramı için 10ml lizis tamponu (1: 100 artı proteaz inhibitörü) ekleyin, yeniden süspansa, yaklaşık 30 dakika boyunca buza yerleştirin;

7 、 Basınç Ezme: Alkolü yüksek basınçlı homojenleştiriciye koyun, iki kez su ile durulayın, bir kez dengelemek için liziz tamponu kullanın, bakteriyel sıvıyı ekleyin, basınçlandırma (basınç 800kpa'yı geçmemeli), bakteriyel sıvıyı üç ila beş kat daha fazla şeffaf ve yapışkan değil;

8 、 20 dakika için ezilmiş bakteriyel sıvı, 12000g, 4 ℃ santrifüjleme, süpernatan ve çökelme ayırma, her biri jel çalıştırmak için 20μl numune (3) (4) tuttu;

9、2ml Ni-NTA, saflaştırma kolonuna, etanol filtrelenmesi, su ile durulanması ve kolonu dengelemek için lizis tamponu ilave edildi;

10 、 Lizis tamponu Ni-NTA yeniden süspansiyonu ile süpernatana eklenen, iyice karıştırın, 2 saat için 4 ℃ çalkalayıcı inkübasyonu;

11 、 Süpernatan, kolondan 4 ° C'de geçirildi ve 20 ul süzünme toplandı (5);

12 、 Sütunu 3 kez 5ml yıkama tamponu ile yıkayın, süzüntü numunesini 20μl (6) toplayın;

13 、 1ml elüsyon tamponu ekleyin, 5 dakika inkübe edin, elüatı toplayın, 5 kez tekrarlayın, aynı tüpte 5ml elüat toplayın, 20μl numune bırakın (7);

14 、 Deney sırasında elde edilen bireysel protein örnekleri çalıştırıldı, 1 saat boyunca parlak mavi ile boyandı ve arka plan mavisi daha hafif olana ve berrak protein bantları görünene kadar renklendirildi;

15 、 Her bir numunenin protein bantlarını analiz edin, sonraki operasyonun sonuçlarına göre: Elüte edilmiş protein, heterozigot bantlar veya heterozigot bantlar veya daha az ve sığ olmayan proteindeki numuneler ise, diyaliz ve konsantrasyon olabilirse, daha fazla heterozzik bantların diyaliz ve konsantrasyondan sonra tekrar saflaştırılması gerekiyorsa.

16 、 Diyaliz: Numuneyi diyaliz zarına ekleyin, her iki ucunu kelepçe, 4 ℃ gece boyunca diyaliz;

17 、 Konsantrasyon: Uygun konsantrasyon tüpünü seçmek için numunenin moleküler ağırlık boyutuna göre 4 ℃ Düşük hızlı konsantrasyon, protein konsantrasyonu ölçümü konsantrasyonu, etiketleme, sıvı azot hızlı dondurmada ve daha sonra -80 ℃ buzdolabı içinde dondurulur.

Aşağıdaki şekil, in vitro olarak GFP proteini afinite saflaştırmasının bir kofeksiyon grafiğini göstermektedir ve saflaştırılmış proteinin saflığı ve konsantrasyonu büyük ölçüde artmaktadır.