Protein Saflaştırma,    proteinleri kodlayan nükleik asit dizilerinin genetik mühendisliği teknikleriyle konakçı hücrelere sokularak bunların büyük miktarlarda eksprese edilmesini sağlama ve daha sonra yüksek saflıkta, aktivitede ve verimde proteinler elde etmek için uygun saflaştırma yöntemleri kullanılarak in vitro saflaştırma işlemidir . Protein ekspresyon sistemleri olarak kategorize edilebilir prokaryotik sistemler ve ökaryotik sistemler .

yönelik prensipler ve yöntemler Prokaryotik sistemlerde protein ekspresyonunu indüklemeye ve proteinleri in vitro olarak afinite kromatografisi kullanarak saflaştırmaya aşağıda açıklanmaktadır.

1、Laktoz manipülatörünün negatif düzenlenmesi:

Laktozun yokluğunda, lac manipülatörü caydırıcılık durumundadır; bu sırada I dizisi, O dizisine bağlanmak için Lac caydırıcı proteinini eksprese eder, RNA polimerazın P dizisine bağlanmasını önler ve transkripsiyonun başlamasını engeller. Laktoz mevcut olduğunda, laktoz hücreye girer ve β-galaktosidaz tarafından katalize edilir ve izolaktoza dönüştürülür, bu da inhibitör proteine ​​bağlanarak proteinde konformasyonel bir değişikliğe neden olur ve inhibitör proteinin O dizisinden ayrılmasına yol açarak transkripsiyonu başlatır.

İzopropiltiyogalaktoz (IPTG), izogalaktoz ile aynı şekilde etki eder ve bakteriler tarafından metabolize edilmeyen ve çok stabil olan son derece güçlü bir uyarıcıdır ve bu nedenle laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılır.

2、ana bilgisayar türü seçimi:

(1) BL21, prokaryotik ekspresyon için en yaygın olarak kullanılan suşlardan biridir ve temel olarak E. coli polimeraz ile toksik olmayan proteinlerin ekspresyonu için uygundur , dolayısıyla tac veya trc (örn. pGEX, pMAL plazmitleri) gibi E. coli RNA polimerazı kullanılarak prokaryotik sistemlerin ekspresyonuna uygulanabilir.

(2) BL21(DE3), T7 faj RNA polimeraz genini eksprese edebilen BL21 suşunun kromozomu üzerindeki λ faj DE3 bölgesinde entegre eder , hem T7 RNA polimerazı hem de E. coli RNA polimerazı ve pET serisi, pGEX, pMAL ve benzeri gibi plazmidlerin ekspresyonu için kullanılabilir.

3, protein saflaştırma yöntemleri:

(1) Jel ​​filtrasyon kromatografisi: karışımdan proteinleri ayırmak için moleküler boyuta, farklı proteinlerin şekline ve dolgu parçacıkları içeren jel filtrasyon kromatografisi kolonu yoluyla karışımdaki farklılıkların moleküler boyutuna göre, çeşitli proteinlerin moleküler boyutundan dolayı farklıdır, açıklık parçacıklarının spesifik boyutuna difüzyon, değişebilme kabiliyetine sahiptir, protein molekülleri ne kadar büyük olursa, moleküllerden ilk elüte edilecek olan, elüsyon ne kadar geç olursa o kadar küçük olur.

(2) İyon değişim kromatografisi: protein ayırma ve saflaştırma, proteinin yüzeyindeki farklı yüklere dayanır, proteinin yüzeyi genellikle eşit şekilde yüklenir ve belirli koşullar altında katyon/anyon değişim kolonlarıyla birleştirilebilir. pH değiştirildiğinde veya elüsyon için kademeli olarak artan iyon gücüne sahip bir tampon kullanıldığında, bağlı madde elüsyon maddesindeki iyonlarla değiştirilebilir ve solüsyona elüte edilebilir. Farklı maddeler farklı yüklere ve iyon değişim kolonuna farklı bağlanma yeteneklerine sahip olduğundan, çözeltiye aktarılma sırası da farklıdır.

(3) Hidrofobik Kromatografi: Proteinlerin hidrofobikliği kullanılarak, hidrofobik kalıntılar, denatürasyondan sonra veya yüksek tuzlu bir ortamda proteinlerin yüzeyinde açığa çıkar, farklı proteinlerin hidrofobik kalıntıları, sabit fazın hidrofobik ligandları ile farklı etki gücüne sahiptir ve hidrofobiklik, eluent'in iyonik gücünü yüksekten düşüğe doğru kullanarak en zayıftan en güçlüye doğru bileşen ayrımı olarak kullanılabilir.

(4) Afinite kromatografisi: Saflaştırılacak (veya protein üzerinde etiketlenecek) bir proteinin spesifik ligandı, uygun kimyasal yöntemlerle taşıyıcı moleküle kovalent olarak bağlanır. Protein karışımı, afinite ortamı ile doldurulmuş kromatografik kolona eklendiğinde, saflaştırılacak protein spesifik olarak liganda bağlanırken, diğer proteinler bağlanmaz ve yıkanarak uzaklaştırılmaz ve spesifik olarak bağlanan protein, karşılık gelen serbest ligandın bir çözeltisi ile elüte edilebilir. Spesifik olarak bağlanan proteinler, karşılık gelen serbest ligandı içeren bir çözelti ile elüt edilebilir.

4、Protein saflaştırma etiketlerinin seçimi:

Farklı etiketlerin özellikleri aşağıdaki gibidir↓

His-etiketi saflaştırması: His-etiketi, proteinin amino veya karboksil terminaline 6-10 histidinin eklendiği ve hedef proteinin, normal veya denatüre edici koşullar altında (örneğin 8M üre) Ni2+ şelatlayıcı kolonlara sıkı bir şekilde bağlanma yeteneği ile saflaştırıldığı ve ardından imidazol (boncuk yuvalarındaki nikel iyonlarına bağlanmak için rekabet eden) ile elüt edildiği en yaygın kullanılan etiketlerden biridir.

Laboratuvar reaktifleri:

IPTG; LB ortamı;

Lizis tamponu: 20 mM Tris (7.9), 500 mM NaCl, 10 mM İmidazol;

Yıkama tamponu: 20 mM Tris (7.9), 500 mM NaCl, 20 mM İmidazol;

Elüsyon tamponu: 20 mM Tris (7.9), 200 mM NaCl, 300 mM İmidazol ( İmidazol konsantrasyonu elüsyon verimliliğine göre ayarlanabilir );

Diyaliz solüsyonu: 20 mM Tris (7.9), 50 mM NaCl, %10 gliserol;

Kaomas Brilliant Blue boyama çözümü; renk giderici çözüm

Araçlar:

Ni-NTA, ultrasonik kırıcı, kromatografi kolonu, konsantrasyon tüpleri

1、Prokaryotik ekspresyon plazmidinin oluşturulması: Hedef genin PCR'si, vektör sindirimi, ligasyon, transformasyon, sekanslama için tek klonun seçilmesi;

2、Başarıyla oluşturulan plazmidi BL21(DE3)'e dönüştürün, gece boyunca 37°C'de inkübe edin ve gece boyunca küçük çalkalama için tek klonu seçin;

3、En iyi indüksiyon koşullarını bulmak için küçük indüksiyon: gece boyunca çalkalanacak bakteriyel çözelti 1:1000 aşılama 3mL LB'ye, 37 °C'de 4-5 saat boyunca bakteriyel çözelti OD600 = 0.6-0.8'e kadar çalkalanacak, farklı IPTG konsantrasyonları (0.1-1 mM) eklenecek, farklı sıcaklıklar, sıcaklığın düşürülmesiyle indüksiyon süresi uzatılacak, örneğin 37 °C'nin indüklenmesi 4-5saat, 30°C kaynaklı 6saat-8saat, 16°C kaynaklı 16-20saat, 16°C kaynaklı 16-20saat, sıcaklık azaltılır, süre uzatılır, örneğin 37°C kaynaklı 4-5saat, 30°C kaynaklı 6saat-8saat, 16°C kaynaklı 16-20saat, sıcaklık azaltılır. 16-20 saat boyunca C'de, farklı indüksiyon koşulları altında indüksiyondan önce ve sonra bakteri özsuyu alın, jeli çalıştırın, lekeleyin ve indüksiyon sonuçlarını gözlemleyin; (Genel olarak konuşursak, IPTG konsantrasyonu ne kadar düşükse ve indüksiyon sıcaklığı ne kadar düşükse, hedef proteinin ekspresyonu o kadar yavaş olur, proteinlerin doğru katlanmasına o kadar yardımcı olur, böylece çözünürlükleri artar ve inklüzyon cisimciklerinin oluşumu azalır)

4、En uygun indüksiyon koşullarını bulduktan sonra, bakteriyel solüsyonu 1:1000'i 2L LB'ye aşılayın, bakteriyel solüsyonun OD600'ü=0,6-0,8 olana kadar 37°C'de sallayın, 20μL bakteriyel solüsyonu aspire edin ve jeli çalıştırmaya bırakın (1), ardından ön deneyde elde edilen uygun indüksiyon koşulları altında protein ekspresyonunu indükleyin ve 20μL bakteriyel aspire edin çözeltiyi çözün ve jelin akması için bırakın (2);

5、İndüklenen bakteriyel sıvıyı çıkarın, 4000g'de 15 dakika boyunca 4°C'de santrifüj edin;

6、 Süpernatantı atın, tartın, her gram bakteri için 10 mL Lizis tamponu (1:100 artı proteaz inhibitörü) ekleyin, yeniden süspanse edin, yaklaşık 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin;

7、Basınçlı kırma: alkolü yüksek basınçlı homojenleştiriciye koyun, iki kez suyla durulayın, bir kez dengelemek için Lizis tamponu kullanın, bakteriyel sıvıyı ekleyin, basınçlandırın (basınç 800kpa'yı geçmemelidir), bakteriyel sıvıyı üç ila beş kez şeffaf hale getirin ve yapışkan olmayın;

8、Ezilmiş bakteriyel sıvıyı toplayın, 12000g, 20 dakika boyunca 4°C'de santrifüjleme, süpernatan ve çökelti ayırma, her biri jeli çalıştırmak için 20μL örnek (3) (4) tuttu;

9、2 mL Ni-NTA, etanolle filtrelenecek olan saflaştırma kolonuna ilave edildi, suyla durulandı ve kolonu dengelemek için Lizis tamponu ilave edildi;

10、 Süpernatanta Lizis tamponu Ni-NTA yeniden süspansiyonu eklendiğinde iyice karıştırın, 2 saat süreyle 4°C çalkalayıcıda inkübasyon yapın;

11、Süzer madde 4°C'deki kolondan geçirildi ve 20 μL süzüntü toplandı (5);

12、Sütunu 5 mL Yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın, süzüntü örneğini 20μL (6) toplayın;

13、1 mL Elüsyon tamponu ekleyin, 5 dakika inkübe edin, eluatı toplayın, 5 kez tekrarlayın, aynı tüpte 5 mL elüat toplayın, 20μL numune bırakın (7);

14、 Deney sırasında elde edilen bireysel protein numuneleri çalıştırıldı, 1 saat boyunca Caumas Brilliant Blue ile boyandı ve arka plandaki mavi renk daha açık hale gelene ve berrak protein bantları görünene kadar rengi giderildi;

15、Sonraki işlemin sonuçlarına göre her numunenin protein bantlarını analiz edin: Heterozigot bantlar veya heterozigot bantlar olmayan veya daha az ve sığ olan proteindeki elüt edilen protein numuneleri diyaliz ve konsantrasyon olabilirse, daha fazla heterozigot bandın diyaliz ve konsantrasyondan sonra tekrar saflaştırılması gerekiyorsa.

16、Diyaliz: numuneyi diyaliz membranına ekleyin, her iki ucu da kelepçeleyin, gece boyunca 4°C'de diyaliz yapın;

17、Konsantrasyon: Numunenin moleküler ağırlık boyutuna göre uygun konsantrasyon tüpünü seçmek için 4°C düşük hızlı konsantrasyon, protein konsantrasyonu ölçümü konsantrasyonu, etiketleme, sıvı nitrojende hızlı dondurma ve daha sonra -80°C buzdolabında dondurulma.

Aşağıdaki şekil, in vitro GFP protein afinite saflaştırmasının kofeksiyon grafiğini göstermektedir ve saflaştırılmış proteinin saflığı ve konsantrasyonu büyük ölçüde arttırılmıştır.