Čistenie proteínu    je proces zavádzania sekvencií nukleových kyselín kódujúcich proteíny do hostiteľských buniek prostredníctvom genetického inžinierskeho techniky, čo spôsobuje, že sa exprimujú vo veľkých množstvách, a ich čistenie in vitro pomocou vhodných čistiacich metód, aby sa získali proteíny s vysokou čistotou, aktivitou a výťažkom . Proteínové expresné systémy môžu byť rozdelené do prokaryotických systémov a eukaryotických systémov.

Princípy a metódy na vyvolanie expresie proteínov v prokaryotických systémoch a čistenie proteínov in vitro pomocou afinitnej chromatografie sú opísané nižšie.

1 、 Negatívna regulácia manipulátora laktózy:

V neprítomnosti laktózy je manipulátor LAC v stave odstrašenia, v ktorom v čase I sekvencia I exprimuje LAC odrazový proteín za viazanie na sekvenciu O, čo bráni viazaniu RNA polymerázy v väzbe na P p -sekvenciu a inhibujú inhibíciu transkripčnej iniciácie. Ak je prítomná laktóza, laktóza vstúpi do bunky a je katalyzovaná p-galaktozidázou a konvertovaná na izolaktózu, ktorá sa viaže na inhibičný proteín, čo spôsobuje konformačnú zmenu v proteíne a vedie k disociácii inhibičného proteínu z O sekvencie O sekvenciu, čím iniciuje transkripciu.

Izopropyltiogalaktozid (IPTG) pôsobí rovnako ako izogalaktóza a je mimoriadne silným induktorom, ktorý nie je metabolizovaný baktériami a je veľmi stabilný, a preto sa široko používa v laboratóriách.

2 、 Výber kmeňa hostiteľa:

(1) BL21 je jedným z najbežnejšie používaných kmeňov na prokaryotickú expresiu, ktorý je vhodný hlavne na expresiu netoxických proteínov s E. coli polymerázou, takže sa môže aplikovať na expresiu prokaryotických systémov s použitím E. coli RNA polymerázy, ako je TAC alebo TRC (EG PGEX, pmálne plazmidy).

(2) BL21 (DE3) integruje gén fágovej RNA polymerázy T7 v oblasti A fágu DE3 na chromozóme kmeňa BL21, ktorý môže exprimovať T7 RNA polymerázu a E. coli RNA polymerázu a môže sa použiť na expresiu plazmidov, ako je PET séria, PET, PGEX, PMAL, a tak ďalej.

3, metódy čistenia proteínov:

(1) Gélová filtračná chromatografia: Podľa molekulárnej veľkosti od zmesi na samostatné proteíny sa tvar rôznych proteínov a molekulárna veľkosť rozdielov v zmesi prostredníctvom gélovej filtrácie chromatografie obsahujúca výplňové častice obsahujúce výplňové častice, v dôsledku molekulárnej veľkosti proteínov, sa líšia. Elukované z molekúl sú menšie, čím neskôr elúcia.

(2) Chromatografia výmeny iónov: Separácia a čistenie proteínov sú založené na rôznych nábojoch na povrchu proteínu, povrch proteínu sa zvyčajne rovnomerne nabije a za určitých podmienok sa môže kombinovať s katiónovými/aniónovými výmennými stĺpcami. Keď sa pH zmení alebo sa na elúciu použije tlmivý roztok s postupne zvyšujúcou sa iónovou pevnosťou, viazaná látka sa môže vymeniť s iónmi v Eluente a eluovaná do roztoku. Pretože rôzne látky majú rôzne náboje a rôzne väzobné schopnosti so stĺpcom iónovej výmeny, poradie eluácie do roztoku sa tiež líši.

(3) Hydrofóbna chromatografia: Pri použití hydrofóbnosti proteínov sa hydrofóbne zvyšky vystavia na povrchu proteínov po denaturácii alebo v prostredí s vysokou soľou a hydrofóbne zvyšky rôznych proteínov majú rôzne silné sily účinku s hydrofóbnym ligandom stacionárnej fázy, a hydrofóbia sa môže využívať ako slabá zložka na vysokú zložku z dôvodu na nízku.

(4) Afinitná chromatografia: Špecifický ligand proteínu, ktorý sa má vyčistiť (alebo označený na proteíne), je kovalentne viazaný na molekulu nosiča vhodnými chemickými metódami. Keď sa proteínová zmes pridá do chromatografickej kolóny naplnenej afinitným médiom, proteín, ktorý sa má purifikovať, je špecificky viazaný na ligand, zatiaľ čo ostatné proteíny nie sú viazané a odstránené premytím a špecificky viazaný proteín sa dá eluovať roztokom voľného zodpovedajúceho ligandu. Konkrétne viazané proteíny sa môžu eluovať roztokom obsahujúcim voľný zodpovedajúci ligand.

4 、 Výber štítkov na čistenie proteínov:

Charakteristiky rôznych štítkov sú nasledujúce ↓

His-tag purification: His-tag is one of the most commonly used tags, where 6-10 histidine are added to the amino or carboxyl terminus of the protein, and the target protein is purified by its ability to bind tightly to Ni2+ chelating columns under normal or denaturing conditions (eg, 8M urea), and then eluted with imidazole (which competes for binding to nickel ions in the bead wells).

Laboratórne činidlá:

Iptg; LB médium;

Lýza pufri: 20 mM Tris (7,9), 500 mm NaCl, 10 mm imidazol;

Premytý pufr: 20 mm Tris (7,9), 500 mm NaCl, 20 mm imidazol;

Elučný pufr: 20 mm TRIS (7,9), 200 mm NaCl, 300 mm imidazol ( koncentrácia imidazolu je možné upraviť podľa účinnosti elúcie );

Dialyzačný roztok: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10% glycerol;

Kaomas brilantný modrý roztok farbenia; odfarbenie roztoku

Nástroje:

Ni-NTA, ultrazvukový istič, chromatografia, koncentračné trubice

1 、 Konštrukcia prokaryotického expresného plazmidu: PCR cieľového génu, štiepenie vektorov, ligácia, transformácia, vyberanie jediného klonu na sekvenovanie;

2 、 Transformujte úspešne skonštruovaný plazmid na BL21 (DE3), inkubujte pri 37 ℃ cez noc a vyberte jediný klon pre malé trasenie cez noc;

3 、 malá indukcia na zistenie najlepších indukčných podmienok: Budú otrasené cez noc Bakteriálny roztok 1: 1000 Onokulácie do 3 ml lb, 37 ℃ Trasenie 4-5 H, bude otrasené OD600 = 0,6-0,8, pridajte rôzne koncentrácie IPTG (0,1-1M), rôzne teploty, pričom sa rozširuje rôzne koncentrácie IPTG, ako je 37H, INDUKUDU Indukovaný 6H-8H, 16 ℃ vyvolaný 16-20H, 16 ° C indukovaný 16-20H, teplota sa skráti, čas sa predĺži, ako napríklad 37 ℃ indukovaná 4-5H, 30 ℃ vyvolaná 6H-8H, 16 ° C, vyvolaná teplota 16 až 20H, teplota sa zníži. C Po dobu 16-20 h, bakteriálnu miazgu pred a po indukcii vezmite za rôzne indukčné podmienky, spustite gél, farbenie a pozorujte výsledky indukcie; (Všeobecne povedané, čím nižšia je koncentrácia IPTG a nižšia teplota indukcie, tým pomalšia je expresia cieľového proteínu, tým viac vedie k správnemu skladaniu proteínov, čím sa zvyšuje ich rozpustnosť a znižuje tvorbu inklúznych teliesok)

4 、 Po nájdení najvhodnejších indukčných podmienok inokulujte bakteriálny roztok 1: 1000 do 2 l LB, pretrepte sa pri 37 ℃, až kým OD600 bakteriálneho roztoku = 0,6-0,8, aspirát 20 μl bakteriálneho roztoku a nechajte ho spustiť gél (1), potom indukujte expresiu proteínu za vhodných indukčných podmienok dosiahnutých v predbežnom expresi Nechajte ho spustiť gél (2);

5 、 Odstráňte indukovanú bakteriálnu kvapalinu, odstredivku pri 4000 g počas 15 minút pri 4 ℃;

6 、 Zlikvidujte supernatant, vážte, pridajte 10 ml lyzačný tlmivý roztok (1: 100 plus proteázový inhibítor) pre každý gram baktérií, resuspend, umiestnite na ľad asi 30 minút;

7 、 Drvenie tlaku: Odložte alkohol do vysokotlakového homogenizátora, opláchnite vodou dvakrát, pomocou lyzačného pufra na vyváženie raz, pridajte bakteriálnu kvapalinu, tlak (tlak by nemalo prekročiť 800 kPa), bakteriálna kvapalina počas troch až päťkrát do priehľadnej a lepkavej;

8 、 Zhromaždite drvenú bakteriálnu kvapalinu, 12000 g, 4 ℃ odstredivky pre 20 minút, supernatantnú a zrazenú separáciu, každá si zachovala 20 ul vzorky (3) (4), ktorá sa má spustiť gél;

Do kolóny čistenia sa pridal 9、2ML Ni-NTA, ktorý sa má filtrovať etanol, opláchnutý vodou a pridaný lyzačný pufor na rovnováhu stĺpca;

10 、 s resuspenziou Ni-NTA s lýzou NI-NTA pridanou do supernatantu, dobre mix, inkubácia 4 ℃ Shaker Inkubácia na 2 hodinu;

11 、 Supernatant prešiel cez stĺpec pri 4 ° C a zhromaždilo sa 20 ul filtrátu (5);

12 、 Kolóna premyjte 5 ml premytiaceho tlmivého roztoku trikrát, zbierajte vzorku filtrátu 20 ul (6);

13 、 Pridajte 1 ml elučný pufr, inkubujte 5 minút, zbierajte eluátu, opakujte 5 -krát, zbierajte 5 ml eluátu v tej istej trubici, nechajte 20 ul vzorky (7);

14 、 Jednotlivé vzorky proteínov získané v priebehu experimentu boli spustené, zafarbené CAUMAS brilantnou modrou na 1h a odfarbené, až kým nebola viditeľná modrá farba pozadia a boli viditeľné číre proteínové pásy;

15 、 Analyzujte proteínové pásma každej vzorky podľa výsledkov následnej operácie: ak eluované vzorky proteínov vo proteíne bez heterozygotných pásov alebo heterozygotných pásov alebo menej a plytkých môžu byť dialýzou a koncentráciou, ak sa po dialýze a koncentrácii musia znova vyčistiť.

16 、 Dialýza: Pridajte vzorku do dialyzačnej membrány, zložte oba konce, dialýzu pri 4 ℃ cez noc;

17 、 Koncentrácia: Podľa molekulovej veľkosti hmotnosti vzorky, aby sa zvolila príslušná koncentračná trubica 4 ℃ koncentrácia s nízkou rýchlosťou, koncentrácia merania koncentrácie proteínu, značenie, v rýchlom zmrazení kvapalného dusíka a potom zmrazená v -80 ℃ chladničke.

Obrázok nižšie zobrazuje kofecčný graf afinity GFP proteínu in vitro a čistota a koncentrácia purifikovaného proteínu sa výrazne zvýši