Purifikácia proteínov    je proces zavádzania sekvencií nukleových kyselín kódujúcich proteíny do hostiteľských buniek pomocou techník genetického inžinierstva, čím sa spôsobí ich expresia vo veľkých množstvách a potom sa ich purifikuje in vitro pomocou vhodných purifikačných metód, aby sa získali proteíny vysokej čistoty, aktivity a výťažku . Proteínové expresné systémy možno kategorizovať na prokaryotické systémy a eukaryotické systémy.

Princípy a spôsoby indukcie expresie proteínov v prokaryotických systémoch a purifikácie proteínov in vitro pomocou afinitnej chromatografie sú opísané nižšie.

1, Negatívna regulácia laktózového manipulátora:

V neprítomnosti laktózy je lac manipulátor v stave odstrašenia, kedy I sekvencia exprimuje Lac odstrašujúci proteín, aby sa naviazal na O sekvenciu, čím bráni RNA polymeráze naviazať sa na P sekvenciu a inhibuje iniciáciu transkripcie. Keď je prítomná laktóza, laktóza vstúpi do bunky a je katalyzovaná β-galaktozidázou a prevedená na izolaktózu, ktorá sa viaže na inhibičný proteín, čo spôsobuje konformačnú zmenu v proteíne a vedie k disociácii inhibičného proteínu od O sekvencie, čím sa iniciuje transkripcia.

Izopropyltiogalaktozid (IPTG) pôsobí rovnakým spôsobom ako izogalaktóza a je mimoriadne účinným induktorom, ktorý nie je metabolizovaný baktériami a je veľmi stabilný, a preto sa široko používa v laboratóriách.

2, výber hostiteľského kmeňa:

(1) BL21 je jeden z najčastejšie používaných kmeňov na prokaryotickú expresiu, ktorý je vhodný hlavne na expresiu netoxických proteínov s E. coli polymerázou, preto ho možno aplikovať na expresiu prokaryotických systémov pomocou E. coli RNA polymerázy ako je tac alebo trc (napr. pGEX, pMAL plazmidy).

(2) BL21(DE3) integruje gén T7 fágovej RNA polymerázy v oblasti λ fága DE3 na chromozóme kmeňa BL21, ktorý môže exprimovať T7 RNA polymerázu aj E. coli RNA polymerázu a môže sa použiť na expresiu plazmidov, ako je séria pET, pGEX, pMAL atď.

3, metódy čistenia bielkovín:

(1) Gélová filtračná chromatografia: podľa veľkosti molekúl od zmesi k oddeleným proteínom, tvaru rôznych proteínov a veľkosti molekúl rozdielov v zmesi cez gélovú filtračnú chromatografickú kolónu obsahujúcu častice plniva, v dôsledku molekulárnej veľkosti rôznych proteínov sú rôzne, difúzia do špecifickej veľkosti apertúrových častíc so schopnosťou meniť sa, čím väčšie budú neskoršie molekuly, ktoré budú eluované ako prvé, tým menšie molekuly budú eluované ako prvé.

(2) Iónomeničová chromatografia: separácia a čistenie proteínov je založené na rôznych nábojoch na povrchu proteínu, povrch proteínu je zvyčajne rovnomerne nabitý a za určitých podmienok sa môže kombinovať s katiónovými/aniónovými výmennými kolónami. Keď sa zmení pH alebo sa na elúciu použije tlmivý roztok s postupne sa zvyšujúcou iónovou silou, naviazaná látka sa môže vymeniť s iónmi v eluente a eluovať do roztoku. Pretože rôzne látky majú rôzne náboje a rôzne väzbové schopnosti s iónomeničovou kolónou, poradie eluovania do roztoku je tiež odlišné.

(3) Hydrofóbna chromatografia: Použitím hydrofóbnosti proteínov budú hydrofóbne zvyšky vystavené na povrchu proteínov po denaturácii alebo v prostredí s vysokým obsahom solí, hydrofóbne zvyšky rôznych proteínov majú rôznu silu účinku s hydrofóbnymi ligandami stacionárnej fázy a hydrofóbnosť môže byť použitá ako separácia od najslabšej po najsilnejšiu iónovú zložku.

(4) Afinitná chromatografia: špecifický ligand proteínu, ktorý má byť purifikovaný (alebo označený na proteíne), je kovalentne pripojený k molekule nosiča vhodnými chemickými metódami. Keď sa proteínová zmes pridá do chromatografickej kolóny naplnenej afinitným médiom, proteín, ktorý sa má purifikovať, sa špecificky naviaže na ligand, zatiaľ čo ostatné proteíny sa neviažu a neodstránia sa premytím a špecificky naviazaný proteín sa môže eluovať roztokom voľného zodpovedajúceho ligandu. Špecificky viazané proteíny môžu byť eluované roztokom obsahujúcim voľný zodpovedajúci ligand.

4、Výber značiek na čistenie proteínov:

Charakteristiky rôznych označení sú nasledovné↓

Purifikácia His-tag: His-tag je jedným z najbežnejšie používaných tagov, kde sa 6-10 histidínov pridá na amino alebo karboxylový koniec proteínu a cieľový proteín sa purifikuje svojou schopnosťou pevne sa viazať na Ni2+ chelatačné kolóny za normálnych alebo denaturačných podmienok (napr. 8M močovina) a potom sa eluuje imidazolom (ktorý nikel súťaží o väzbu na väzbu).

Laboratórne činidlá:

IPTG; LB médium;

Lyzačný pufor: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCI, 10 mM imidazol;

Premývací pufor: 20 mM Tris (7,9), 500 mM NaCI, 20 mM imidazol;

Elučný pufor: 20 mM Tris (7,9), 200 mM NaCI, 300 mM imidazol ( koncentrácia imidazolu sa môže upraviť podľa účinnosti elúcie );

Dialyzačný roztok: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCI, 10 % glycerol;

farbiaci roztok Kaomas Brilliant Blue; odfarbovacím roztokom

Nástroje:

Ni-NTA, ultrazvukový prerušovač, chromatografická kolóna, koncentračné skúmavky

1、Konštrukcia prokaryotického expresného plazmidu: PCR cieľového génu, štiepenie vektorom, ligácia, transformácia, výber jedného klonu na sekvenovanie;

2、Transformujte úspešne skonštruovaný plazmid na BL21(DE3), inkubujte pri 37 °C cez noc a vyberte jeden klon na malé pretrepávanie cez noc;

3、Malá indukcia na zistenie najlepších podmienok indukcie: pretrepáva sa cez noc bakteriálny roztok 1:1000 inokulácia do 3ml LB, 37 ℃ pretrepáva 4-5h do bakteriálneho roztoku OD600 = 0,6-0,8, pridajú sa rôzne koncentrácie IPTG (0,1-1mM sa predlžuje doba, napr. pri rôznych teplotách), 37 ℃ indukované 4-5h, 30 ℃ indukované 6h-8h, 16 ℃ indukované 16-20h, 16°C indukované 16-20h, teplota sa zníži, čas sa predĺži, napr. 16-20h sa teplota zníži. C počas 16-20h, odoberte bakteriálnu šťavu pred a po indukcii za rôznych podmienok indukcie, spustite gél, zafarbite a pozorujte výsledky indukcie; (Všeobecne povedané, čím nižšia je koncentrácia IPTG a čím nižšia je indukčná teplota, tým pomalšia je expresia cieľového proteínu, tým viac prispieva k správnemu skladaniu proteínov, čím sa zvyšuje ich rozpustnosť a znižuje sa tvorba inklúznych teliesok)

4、Po nájdení najvhodnejších podmienok indukcie naočkujte bakteriálny roztok v pomere 1:1000 do 2 l LB, pretrepte pri 37 °C, kým OD600 bakteriálneho roztoku = 0,6-0,8, odsajte 20 μl bakteriálneho roztoku a nechajte ho bežať na géli (1), potom indukujte predexperimentáciu a získanú expresiu proteínu pri expresii proteínu 20 μl bakteriálneho roztoku a nechajte ho pustiť gél (2);

5、Odstráňte indukovanú bakteriálnu kvapalinu, centrifugujte pri 4000 g počas 15 minút pri 4 °C;

6、Zlikvidujte supernatant, odvážte, pridajte 10 ml lyzačného pufra (1:100 plus inhibítor proteázy) na každý gram baktérií, resuspendujte, umiestnite na ľad na približne 30 minút;

7、Tlakové drvenie: odložte alkohol do vysokotlakového homogenizátora, dvakrát opláchnite vodou, raz použite lyzačný pufor na vyváženie, pridajte bakteriálnu kvapalinu, natlakujte (tlak by nemal prekročiť 800 kpa), bakteriálnu kvapalinu trikrát až päťkrát, aby bola priehľadná a nelepivá;

8、Zoberte rozdrvenú bakteriálnu kvapalinu, 12 000 g, odstreďovanie pri 4 °C počas 20 minút, separáciu supernatantu a zrazeniny, z ktorých každá ponechala 20 μl vzorky (3) (4), ktorá sa má použiť na gél;

Do purifikačnej kolóny sa pridalo 9,2 ml Ni-NTA, aby sa etanol prefiltroval, prepláchol vodou a pridal sa lyzačný pufor, aby sa kolóna ekvilibrovala;

10、S lyzačným pufrom Ni-NTA resuspenzia pridaným do supernatantu, dobre premiešajte, inkubácia na trepačke pri 4 °C počas 2 hodín;

11. Supernatant prešiel cez kolónu pri 4 °C a zhromaždilo sa 20 ul filtrátu (5);

12、Premyte kolónu 5 ml 3-krát premývacieho pufra, odoberte vzorku filtrátu 20 μl (6);

13、Pridajte 1 ml elučného tlmivého roztoku, inkubujte 5 minút, odoberte eluát, opakujte 5-krát, odoberte 5 ml eluátu do rovnakej skúmavky, ponechajte 20 μl vzorky (7);

14. Jednotlivé vzorky proteínov získané v priebehu experimentu sa analyzovali, farbili sa s Caumas Brilliant Blue počas 1 hodiny a odfarbovali sa, kým nebola modrá farba pozadia svetlejšia a neboli viditeľné číre proteínové pásy;

15、Analyzujte proteínové pásy každej vzorky podľa výsledkov následnej operácie: ak eluované proteínové vzorky v proteíne bez heterozygotných pásov alebo heterozygotných pásov alebo menej a plytké, môžu byť dialýzované a koncentrované, ak je potrebné po dialýze a koncentrácii znova purifikovať viac heterozygotných pásov.

16、Dialýza: pridajte vzorku do dialyzačnej membrány, oba konce zopnite, dialýzu pri 4 °C cez noc;

17、Koncentrácia: podľa veľkosti molekulovej hmotnosti vzorky vyberte vhodnú koncentračnú skúmavku 4 ℃ nízkorýchlostnú koncentráciu, meranie koncentrácie proteínu, označovanie, rýchle zmrazenie v tekutom dusíku a potom zmrazenie v chladničke -80 ℃.

Obrázok nižšie ukazuje kofekčný graf afinitnej purifikácie GFP proteínu in vitro a čistota a koncentrácia purifikovaného proteínu je značne zvýšená