La purification des protéines    est le processus d'introduction de séquences d'acide nucléique codant pour les protéines dans les cellules hôtes par le biais de techniques de génie génétique, ce qui les a exprimés en grande quantité, puis en les purifiant in vitro en utilisant des méthodes de purification appropriées afin d'obtenir des protéines de grande pureté, d'activité et de rendement . Les systèmes d'expression des protéines peuvent être classés en systèmes procaryotes et systèmes eucaryotes.

Les principes et méthodes d'induction de l'expression des protéines dans les systèmes procaryotes et les protéines purifiant in vitro à l'aide de la chromatographie d'affinité sont décrits ci-dessous.

1 、 Régulation négative du manipulateur de lactose:

En l'absence de lactose, le manipulateur LAC est dans un état de dissuasion, moment où la séquence I exprime la protéine dissuasive LAC pour se lier à la séquence O, empêchant l'ARN polymérase de se lier à la séquence P et d'inhiber l'initiation de la transcription. Lorsque le lactose est présent, le lactose entre dans la cellule et est catalysé par la β-galactosidase et converti en isactose, qui se lie à la protéine inhibitrice, provoquant un changement conformationnel dans la protéine et conduisant à la dissociation de la protéine inhibitrice de la séquence O, en initiant ainsi la transcription.

L'isopropylthiogalactoside (IPTG) agit de la même manière que l'isogalactose et est un inducteur extrêmement puissant qui n'est pas métabolisé par les bactéries et est très stable, et est donc largement utilisé dans les laboratoires.

2 、 Sélection de déformation de l'hôte:

(1) BL21 est l'une des souches les plus couramment utilisées pour l'expression procaryote, qui convient principalement à l'expression de protéines non toxiques avec E. coli polymérase, donc elle peut être appliquée à l'expression de systèmes procaryotes à l'aide de l'ARN polymérase E. coli tel que TAC ou TRC (EG PGEX, plasmides pmal).

(2) BL21 (DE3) intègre le gène de l'ARN polymérase T7 dans la région de phage de3 λ sur la souche chromosomique de Bl21, qui peut exprimer à la fois l'ARN polymérase T7 et l'ARN polymérase E. coli , et peuvent être utilisées pour l'expression de plasmides tels que la série PET, PGEX, PMAL, et ainsi.

3, Méthodes de purification des protéines:

(1) Chromatographie de filtration sur gel: Selon la taille moléculaire du mélange pour séparer les protéines, la forme de différentes protéines et la taille moléculaire des particules de remplissage, en raison de la taille moléculaire de diverses protéines sont différentes, la diffusion dans la taille spécifique de l'aperture des particules de la capacité à faire actualiser, la protéine est plus grande à la molle spécifique de la première des particules de la capacité à faire actualiser, la protéine est plus Pour être élue hors des molécules, il est plus petit, plus tard, plus tard l'élution.

(2) Chromatographie d'échange d'ions: la séparation et la purification des protéines sont basées sur les différentes charges à la surface de la protéine, la surface de la protéine est généralement uniformément chargée et peut être combinée avec des colonnes d'échange cation / anion dans certaines conditions. Lorsque le pH est modifié ou qu'un tampon avec une force ionique croissante augmente progressivement pour l'élution, la substance liée peut être échangée avec les ions dans l'éluant et élués dans la solution. Étant donné que différentes substances ont des charges différentes et des capacités de liaison différentes avec la colonne d'échange d'ions, l'ordre d'être élué en solution est également différent.

(3) Hydrophobic Chromatography: Using the hydrophobicity of proteins, hydrophobic residues will be exposed on the surface of proteins after denaturation or in a high salt environment, the hydrophobic residues of different proteins have different strengths of action with the hydrophobic ligands of the stationary phase, and hydrophobicity can be used as a weakest to strongest component separation by using the ionic strength of the eluent in order from high to faible.

(4) Chromatographie d'affinité: le ligand spécifique d'une protéine à purifier (ou marqué sur la protéine) est attaché de manière covalente à la molécule porteuse par des méthodes chimiques appropriées. Lorsque le mélange de protéines est ajouté à la colonne chromatographique remplie de milieu d'affinité, la protéine à purifier est spécifiquement liée au ligand, tandis que les autres protéines ne sont pas liées et éliminées par lavage, et la protéine spécifiquement liée peut être éluée avec une solution de ligand correspondant libre. Les protéines spécifiquement liées peuvent être élues avec une solution contenant le ligand correspondant libre.

4 、 Sélection des étiquettes de purification des protéines:

Les caractéristiques des différentes étiquettes sont les suivantes ↓

Purification His-Tag: His-Tag est l'une des étiquettes les plus couramment utilisées, où 6 à 10 histidine sont ajoutées à la terminus amino ou carboxyle de la protéine, et la protéine cible est purifiée par sa capacité à se lier étroitement aux colonnes chélatantes Ni2 + dans des conditions normales ou dénaturantes (EG, 8M Urea), puis dans le puits imidazole (qui concourt pour le lien.

Réactifs de laboratoire:

Iptg; Moyen LB;

Tampon de lyse: Tris 20 mM (7,9), NaCl 500 mM, 10 mM d'imidazole;

Tampon de lavage: Tris 20 mM (7,9), NaCl 500 mM, imidazole 20 mM;

Tampon d'élution: Tris 20 mm (7,9), NaCl 200 mm, imidazole de 300 mm ( la concentration d'imidazole peut être ajustée en fonction de l'efficacité d'élution );

Solution de dialyse: Tris 20 mM (7,9), NaCl 50 mM, 10% de glycérol;

Solution de coloration bleu brillant Kaomas; Solution de décoloration

Instruments:

Ni-NTA, briseur à ultrasons, colonne de chromatographie, tubes de concentration

1 、 Construction du plasmide d'expression procaryote: PCR du gène cible, digestion vectorielle, ligature, transformation, sélectionnant un clone unique pour le séquençage;

2 、 Transformer le plasmide construit avec succès en BL21 (DE3), incuber à 37 ℃ pendant la nuit, et choisir le clone unique pour de petites tremblements pendant la nuit;

3 、 Petite induction pour découvrir les meilleures conditions d'induction: sera secouée pendant la nuit de la solution bactérienne 1: 1000 dans 3 ml lb, 37 ℃ en tremblant 4-5h à la solution bactérienne OD600 = 0,6-0,8 induit 6H-8H, 16 ℃ induit 16-20h, 16 ° C induit 16 à 20h, la température est réduite, le temps est étendu, tel que 37 ℃ induits 4-5H, 30 ℃ 6H-8H, 16 ° C 16-20h, la température est réduite. C pendant 16-20h, prenez la sève bactérienne avant et après l'induction dans différentes conditions d'induction, exécutez le gel, teint et observez les résultats de l'induction; (D'une manière générale, plus la concentration d'IPTG est faible et plus la température d'induction est faible, plus l'expression de la protéine cible est lente, plus le repliement correct des protéines augmentant, augmentant ainsi leur solubilité et réduisant la génération de corps d'inclusion)

4 、 Après avoir trouvé les conditions d'induction les plus appropriées, inoculez la solution bactérienne 1: 1000 en 2L de LB, secouez à 37 ℃ jusqu'à ce que l'OD600 de la solution bactérienne = 0,6-0,8, aspire à 20 μl de la solution bactérienne et la laisse à gérer le gel (1), puis induit l'expression de la protéine dans la solution d'induction appropriée dans la pré-expans et laissez-le exécuter le gel (2);

5 、 Retirez le liquide bactérien induit, centrifugeuse à 4000g pendant 15 minutes à 4 ℃;

6 、 Jeter le surnageant, peser, ajouter 10 ml de tampon de lyse (1: 100 plus inhibiteur de protéase) pour chaque gramme de bactéries, remettre en suspension, placer sur de la glace pendant environ 30 minutes;

7 、 Écrasement de pression: découragez l'alcool dans l'homogénéisateur à haute pression, rincez avec de l'eau deux fois, utilisez un tampon de lyse pour équilibrer une fois, ajoutez le liquide bactérien, la pression (la pression ne doit pas dépasser 800kpa), le liquide bactérien de plus de trois à cinq fois à transparent et non collant;

8 、 Collectez le liquide bactérien concassé, 12000g, 4 ℃ centrifugation pendant 20 minutes, la séparation surnage et précipitée, chacun a conservé 20 μl d'échantillon (3) (4) pour être géré du gel;

9、2 ml de Ni-NTA a été ajouté à la colonne de purification, pour être filtré à l'éthanol, rincé à l'eau et ajouté de tampon de lyse pour équilibrer la colonne;

10 、 avec un tampon de lyse Ni-NTA respension ajouté au surnageant, bien mélanger, 4 ℃ incubation de shaker pour 2h;

11 、 Le surnageant a été passé à travers la colonne à 4 ° C et 20 μL de filtrat ont été collectés (5);

12 、 Lavez la colonne avec un tampon de lavage de 5 ml 3 fois, collectez l'échantillon de filtrat 20 μl (6);

13 、 Ajouter un tampon d'élution 1 ml, incuber pendant 5 minutes, récupérer l'éluat, répéter 5 fois, collecter 5 ml d'éluat dans le même tube, laisser 20 μl d'échantillon (7);

14 、 Les échantillons de protéines individuels obtenus au cours de l'expérience ont été exécutés, colorés avec du bleu brillant de Caumas pendant 1h, et décolorisés jusqu'à ce que la couleur bleue de fond soit plus légère et que des bandes de protéines claires étaient visibles;

15 、 Analyser les bandes de protéines de chaque échantillon, selon les résultats de l'opération ultérieure: si les échantillons de protéines élués dans la protéine sans bandes hétérozygotes ou bandes hétérozygotes ou moins et peu profondes, peuvent être à nouveau purifiées après la dialysie et la concentration.

16 、 Dialyse: Ajoutez l'échantillon dans la membrane de dialyse, serrez les deux extrémités, dialyse à 4 ℃ pendant la nuit;

17 、 Concentration: Selon la taille du poids moléculaire de l'échantillon pour choisir le tube de concentration approprié 4 ℃ Concentration à basse vitesse, concentration de mesure de la concentration en protéines, marquage, dans l'azote liquide à congeler rapidement, puis congelé dans -80 ℃ réfrigérateur.

La figure ci-dessous montre un tracé de kofection de la purification de l'affinité des protéines GFP in vitro, et la pureté et la concentration de la protéine purifiée sont considérablement augmentées