تصفیه پروتئین    فرآیند معرفی توالی اسید نوکلئیک برای پروتئین ها از طریق تکنیک های مهندسی ژنتیک ، باعث می شود که آنها در مقادیر زیادی بیان شوند و سپس با استفاده از روشهای تصفیه مناسب ، آنها را در شرایط آزمایشگاهی تصفیه کنند تا پروتئین های خلوص بالا ، فعالیت و عملکرد را بدست آورند . سیستم های بیان پروتئین را می توان در سیستم های پروکاریوتی و سیستم های یوکاریوتی طبقه بندی کرد.

اصول و روشهای القاء بیان پروتئین در سیستم های پروکاریوتی و تصفیه پروتئین ها در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از کروماتوگرافی ترکیبی در زیر شرح داده شده است.

1 、 تنظیم منفی Manipulator Lactose:

در صورت عدم وجود لاکتوز ، دستگیرنده LAC در حالت بازدارندگی قرار دارد ، در این زمان توالی I پروتئین بازدارنده LAC را برای اتصال به دنباله O بیان می کند ، و از اتصال RNA به دنباله P جلوگیری می کند و مانع از شروع رونویسی می شود. هنگامی که لاکتوز وجود دارد ، لاکتوز وارد سلول می شود و توسط β-galactosidase کاتالیز می شود و به isolactose تبدیل می شود ، که به پروتئین مهاری متصل می شود و باعث ایجاد یک تغییر ساختاری در پروتئین می شود و منجر به تفکیک پروتئین مهاری از دنباله O می شود و از این طریق رونویسی را شروع می کند.

ایزوپروپیلتیوگالاکتوزید (IPTG) به همان روشی که ایزوگالاکتوز عمل می کند عمل می کند و یک القا کننده بسیار قدرتمند است که توسط باکتری ها متابولیزه نمی شود و بسیار پایدار است و بنابراین در آزمایشگاه ها بسیار مورد استفاده قرار می گیرد.

2 、 انتخاب کرنش میزبان:

(1) BL21 یکی از متداول ترین سویه ها برای بیان پروکاریوتی است ، که عمدتا برای بیان پروتئین های غیر سمی با E. coli polymerase مناسب است ، بنابراین می توان با استفاده از بیان سیستم های پروکاریوتی با استفاده از E. coli RNA پلیمراز مانند TAC یا TRC (EG PGEX ، PMAL PLASMIDS) استفاده کرد.

(2) BL21 (DE3) ژن پلیمراز RNA فاژ T7 را در منطقه λ phage de3 بر روی کروموزوم کرنش BL21 ادغام می کند ، که می تواند هر دو پلیمراز T7 RNA را بیان کند ، و می تواند برای بیان پلاسمیدها مانند سری PET ، PGEX ، PGEX ، PMAL ، PMAL و غیره استفاده شود.

3 ، روش های تصفیه پروتئین:

(1) کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل: با توجه به اندازه مولکولی از مخلوط به پروتئین های جداگانه ، شکل پروتئین های مختلف و اندازه مولکولی تفاوت در مخلوط از طریق ستون کروماتوگرافی با استفاده از ژل حاوی ذرات پرکننده ، به دلیل اندازه مولکولی پروتئین های مختلف ، متفاوت است ، انتشار در اندازه خاص از ذرات کم عمودی. بعد از شستشوی بعد از شستشو از مولکول ها خارج شده است.

(2) کروماتوگرافی تبادل یونی: جداسازی و تصفیه پروتئین بر اساس بارهای مختلف بر روی سطح پروتئین ، سطح پروتئین معمولاً به طور یکنواخت بار می شود و می تواند با ستون های تبادل کاتیون/آنیون تحت شرایط خاص ترکیب شود. هنگامی که pH تغییر می کند یا یک بافر با افزایش تدریجی قدرت یونی برای شستشو استفاده می شود ، می توان ماده محدود را با یون های موجود در اشتها رد و بدل کرد و در محلول شسته شد. از آنجا که مواد مختلف دارای هزینه های مختلف و توانایی های مختلف اتصال با ستون Exchange Ion هستند ، ترتیب شسته شدن در محلول نیز متفاوت است.

(3) کروماتوگرافی هیدروفوبیک: با استفاده از آبگریز پروتئین ها ، باقیمانده های آبگریز پس از دناتوراسیون یا در یک محیط نمکی بالا در سطح پروتئین ها قرار می گیرند ، باقیمانده های آبگریز پروتئین های مختلف دارای نقاط قوت عمل با لیگاند های آبگریز از فاز مستقر و با استفاده از قدرت بالا می توانند به عنوان یک مؤلفه ضعیف استفاده شوند. به کم

(4) کروماتوگرافی میل: لیگاند خاص یک پروتئین که باید خالص شود (یا بر روی پروتئین برچسب گذاری شود) با روشهای شیمیایی مناسب به صورت کووالانسی به مولکول حامل وصل می شود. هنگامی که مخلوط پروتئین به ستون کروماتوگرافی پر از محیط میل اضافه می شود ، پروتئین که باید خالص شود به طور خاص به لیگاند محدود می شود ، در حالی که پروتئین های دیگر با شستشو محدود نمی شوند و از بین می روند و پروتئین به طور خاص می تواند با محلول لیگاند مربوطه آزاد شود. پروتئین های محدود به طور خاص را می توان با یک محلول حاوی لیگاند مربوطه آزاد کرد.

4 、 انتخاب برچسب های تصفیه پروتئین:

ویژگی های برچسب های مختلف به شرح زیر است

تصفیه وی در برچسب: برچسب وی یکی از متداول ترین برچسب ها است ، جایی که 6-10 هیستیدین به پایانه آمینه یا کربوکسیل پروتئین اضافه می شود ، و پروتئین هدف با توانایی اتصال محکم به ستون های Ni2+ Chelating در شرایط طبیعی یا دناتوره خالص می شود (به عنوان مثال ، 8m riore) ، و آن را به عنوان risele enale (که از آن استفاده می کند ، با لندز برای ایمیدازول (که از نظر لندز برای Imidazole (Retues to emidazole) است.

معرفهای آزمایشگاهی:

IPTG ؛ رسانه LB ؛

بافر لیز: 20 میلی متر تریس (7.9) ، 500 میلی متر NaCl ، 10 میلی متر ایمیدازول ؛

بافر شستشو: 20 میلی متر تریس (7.9) ، 500 میلی متر سدیم کلسیم ، 20 میلی متر ایمیدازول ؛

بافر شستشو: 20 میلی متر تریس (7.9) ، 200 میلی متر NaCl ، 300 میلی متر ایمیدازول ( غلظت ایمیدازول را می توان با توجه به راندمان شستشو تنظیم کرد ).

محلول دیالیز: 20 میلی متر تریس (7.9) ، 50 میلی متر سدیم کلسیم ، 10 ٪ گلیسرول ؛

راه حل رنگ آمیزی آبی درخشان Kaomas ؛ راه حل تجزیه کننده

سازها:

Ni-NTA ، شکن اولتراسونیک ، ستون کروماتوگرافی ، لوله های غلظت

1 、 ساخت پلاسمید بیان پروکاریوتی: PCR ژن هدف ، هضم بردار ، بستن ، تحول ، انتخاب کلون منفرد برای توالی.

2 、 پلاسمید با موفقیت ساخته شده را به BL21 (DE3) تبدیل کنید ، در یک شب در 37 ℃ انکوبه شوید و کلون منفرد را برای لرزش کوچک یک شبه انتخاب کنید.

3 、 القاء کوچک برای یافتن بهترین شرایط القایی: محلول باکتریایی یک شبه 1: 1000 تلقیح به 3ml lb ، 37 ℃ تکان دادن 4-5 ساعت به محلول باکتریایی OD600 = 0.6-0.8 ، اضافه کردن غلظت های مختلف IPTG (0.1-1mm) ، دمای مختلف ، با دمای 30 ، با کمترین میزان دما ، القاء دما ، اضافه می شود. 6H-8H ، 16 ℃ ناشی از 16-20H ، 16 درجه سانتیگراد ناشی از 16-20H ، درجه حرارت کاهش می یابد ، زمان افزایش می یابد ، مانند 37 ℃ ناشی از 4-5H ، 30 ℃ ناشی از 6H-8H ، 16 درجه سانتیگراد ناشی از 16-20H ، درجه حرارت کاهش می یابد. C به مدت 16-20 ساعت ، شیره باکتریایی را قبل و بعد از القاء در شرایط القایی مختلف مصرف کنید ، ژل را اجرا کنید ، لکه دار شوید و نتایج القای را مشاهده کنید. (به طور کلی ، هرچه غلظت IPTG پایین تر باشد و دمای القایی پایین تر باشد ، بیان پروتئین هدف کندتر ، برای تاشو صحیح پروتئین ها نیز بیشتر باشد ، از این طریق حلالیت آنها را افزایش داده و باعث کاهش تولید اجسام گنجاندن می شود)

4 、 پس از پیدا کردن مناسب ترین شرایط القایی ، محلول باکتریایی 1: 1000 را به 2 لیتر از LB تلقیح کنید ، در 37 ℃ تا زمانی که OD600 از محلول باکتریایی = 0.6-0.8 ، آسپیرات 20μl از محلول باکتریایی را تکان دهید و آن را برای اجرای ژل (1) ترک کنید ، سپس بیان پروتئین را تحت شرایط پیش بینی شده به دست آمده از قبل از EXPEXMENTINGE و Asserate به دست می آورد. (2) ؛

5 、 مایع باکتریایی القا شده ، سانتریفیوژ را در 4000 گرم به مدت 15 دقیقه در 4 ℃ حذف کنید.

6 、 مایع رویی را دور بیندازید ، وزن کنید ، 10 میلی لیتر بافر لیز (1: 100 به علاوه مهار کننده پروتئاز) را برای هر گرم از باکتری ها اضافه کنید ، مجدداً تعلیق کنید ، حدود 30 دقیقه روی یخ قرار دهید.

7 、 خرد کردن فشار: الکل را در هموژنیزر فشار قوی قرار دهید ، دو بار با آب بشویید ، از بافر لیز استفاده کنید تا یک بار تعادل برقرار کنید ، مایع باکتریایی را اضافه کنید ، فشار (فشار نباید از 800kpa باشد) ، مایع باکتریایی بیش از سه تا پنج بار به شفاف و چسبناک نیست.

8 、 مایع باکتریایی خرد شده ، 12000 گرم ، 4 سانتریفیوژ برای 20 دقیقه ، جداسازی مایع رویی و رسوب ، هر یک نمونه 20μl (3) (4) را برای اجرای ژل جمع آوری کرد.

9、2ml Ni-NTA به ستون تصفیه اضافه شد ، تا اتانول فیلتر شود ، با آب شستشو داده شود و بافر لیز را برای تعادل ستون اضافه کند.

10 、 با بافر لیز Ni-NTA به حالت تعلیق اضافه شده به مایع رویی ، مخلوط خوب ، جوجه کشی شاکر 4 ℃ برای 2H ؛

11 supernatant از طریق ستون در دمای 4 درجه سانتیگراد عبور داده شد و 20 میکرولیتر از فیلتر جمع آوری شد (5).

12 、 ستون را با 5 بار بافر شستشوی 5 میلی لیتر بشویید ، نمونه تصفیه 20μL (6) را جمع کنید.

13 、 بافر شستشوی 1 میلی لیتر اضافه کنید ، به مدت 5 دقیقه انکوبه کنید ، Eluate را جمع کنید ، 5 بار تکرار کنید ، 5 میلی لیتر Eluate را در همان لوله جمع کنید ، 20μL نمونه (7) را ترک کنید.

14 、 نمونه های پروتئین فردی به دست آمده در طول آزمایش اجرا شد ، با رنگ آبی درخشان به مدت 1 ساعت رنگ آمیزی شد و تا زمانی که رنگ آبی پس زمینه سبک تر و نوارهای پروتئینی شفاف قابل مشاهده بود ، تجزیه شد.

15 、 باند پروتئین هر نمونه را با توجه به نتایج عملیات بعدی تجزیه و تحلیل کنید: اگر نمونه پروتئین شسته شده در پروتئین بدون باند هتروزیگوت یا باندهای هتروزیگوت یا کمتر و کم عمق ، می تواند دیالیز و غلظت باشد ، اگر باند های ناهمگن بیشتر نیاز به تصفیه مجدد پس از دیالیز و غلظت داشته باشند.

دیالیز 16 、: نمونه را به غشای دیالیز اضافه کنید ، هر دو انتها را گیره ، دیالیز در 4 ℃ یک شبه.

غلظت 17 、: با توجه به اندازه وزن مولکولی نمونه برای انتخاب لوله غلظت مناسب 4 ℃ غلظت کم سرعت ، غلظت اندازه گیری غلظت پروتئین ، برچسب زدن ، در انجماد سریع نیتروژن مایع ، و سپس در یخچال و فریزر -80 یخ زده است.

شکل زیر یک قطعه kofection از تصفیه وابستگی پروتئین GFP در شرایط آزمایشگاهی را نشان می دهد ، و خلوص و غلظت پروتئین خالص بسیار افزایش می یابد