خالص سازی پروتئین    فرآیند معرفی توالی های اسید نوکلئیک کد کننده پروتئین ها به سلول های میزبان از طریق تکنیک های مهندسی ژنتیک است که باعث می شود آنها در مقادیر زیاد بیان شوند و سپس آنها را در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از روش های خالص سازی مناسب برای به دست آوردن پروتئین هایی با خلوص، فعالیت و بازده بالا خالص می کنند . سیستم های بیان پروتئین را می توان به سیستم های پروکاریوتی و سیستم های یوکاریوتی طبقه بندی کرد.

اصول و روش‌های القای بیان پروتئین در سیستم‌های پروکاریوتی و خالص‌سازی پروتئین‌ها در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی در زیر توضیح داده شده است.

1- تنظیم منفی دستکاری کننده لاکتوز:

در غیاب لاکتوز، دستکاری lac در حالت بازدارندگی است، در این زمان توالی I پروتئین بازدارنده Lac را برای اتصال به توالی O بیان می کند و از اتصال RNA پلیمراز به دنباله P و مهار شروع رونویسی جلوگیری می کند. هنگامی که لاکتوز وجود دارد، لاکتوز وارد سلول می شود و توسط β-گالاکتوزیداز کاتالیز می شود و به ایزولاکتوز تبدیل می شود که به پروتئین مهار کننده متصل می شود و باعث تغییر ساختاری در پروتئین می شود و منجر به جدا شدن پروتئین بازدارنده از توالی O می شود و در نتیجه رونویسی را آغاز می کند.

ایزوپروپیل تیوگالاکتوزید (IPTG) مانند ایزوگالاکتوز عمل می کند و یک القا کننده فوق العاده قوی است که توسط باکتری ها متابولیزه نمی شود و بسیار پایدار است و به همین دلیل در آزمایشگاه ها به طور گسترده استفاده می شود.

2، انتخاب سویه میزبان:

(1) BL21 یکی از رایج ترین سویه های مورد استفاده برای بیان پروکاریوتی است که عمدتاً برای بیان پروتئین های غیر سمی با پلیمراز E. coli مناسب است، بنابراین می توان آن را برای بیان سیستم های پروکاریوتی با استفاده از E. coli RNA پلیمراز مانند tac یا trc (به عنوان مثال پلاسمیدهای pGEX، pMAL) اعمال کرد.

(2) BL21(DE3) ژن RNA پلیمراز فاژ T7 را در ناحیه فاژ λ DE3 روی کروموزوم سویه BL21 ادغام می کند، که می تواند هر دو RNA پلیمراز T7 و RNA پلیمراز E. coli را بیان کند و می تواند برای بیان پلاسمیدهایی مانند سری pET، pET، pET، EX و PET استفاده شود.

3، روش های تصفیه پروتئین:

(1) کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل: با توجه به اندازه مولکولی از مخلوط برای جدا کردن پروتئین ها، شکل پروتئین های مختلف و اندازه مولکولی تفاوت در مخلوط از طریق ستون کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل حاوی ذرات پرکننده، با توجه به اندازه مولکولی پروتئین های مختلف متفاوت است، انتشار به اندازه خاص پروتئین دیافراگم متفاوت خواهد بود. اولين مولكولهايي كه از مولكولها شسته مي شوند كوچكتر هستند هر چه شستشو ديرتر باشد.

(2) کروماتوگرافی تبادل یونی: جداسازی و خالص سازی پروتئین بر اساس بارهای مختلف روی سطح پروتئین است، سطح پروتئین معمولاً به طور یکنواخت باردار می شود و می تواند تحت شرایط خاصی با ستون های تبادل کاتیونی/آنیونی ترکیب شود. هنگامی که PH تغییر می کند یا از یک بافر با قدرت یونی به تدریج افزایش می یابد برای شستشو استفاده می شود، ماده متصل شده را می توان با یون های موجود در شوینده مبادله کرد و به محلول شستشو داد. از آنجایی که مواد مختلف دارای بارهای مختلف و توانایی اتصال متفاوت با ستون تبادل یونی هستند، ترتیب شستشو به محلول نیز متفاوت است.

(3) کروماتوگرافی آبگریز: با استفاده از آبگریز بودن پروتئین ها، بقایای آبگریز پس از دناتوره شدن یا در محیطی با نمک بالا بر روی سطح پروتئین ها قرار می گیرند، باقی مانده های آبگریز پروتئین های مختلف دارای قدرت عمل متفاوتی با لیگاندهای آبگریز فاز ساکن هستند و آبگریز بودن را می توان با استفاده از قوی ترین مولفه به ترتیب جدا از هم استفاده کرد. از بالا به پایین

(4) کروماتوگرافی میل ترکیبی: لیگاند اختصاصی پروتئینی که قرار است خالص شود (یا بر روی پروتئین برچسب گذاری شود) با روش های شیمیایی مناسب به مولکول حامل به صورت کووالانسی متصل می شود. هنگامی که مخلوط پروتئین به ستون کروماتوگرافی پر شده با محیط میل ترکیبی اضافه می‌شود، پروتئینی که باید خالص‌سازی شود به طور خاص به لیگاند متصل می‌شود، در حالی که پروتئین‌های دیگر متصل نشده و با شستشو حذف می‌شوند، و پروتئین متصل به‌ویژه را می‌توان با محلولی از لیگاند متناظر آزاد شسته شود. پروتئین‌های متصل به ویژه را می‌توان با محلولی حاوی لیگاند مربوطه آزاد شست.

4، انتخاب برچسب های تصفیه پروتئین:

ویژگی های برچسب های مختلف به شرح زیر است↓

تگ His-tag: His-tag یکی از متداول‌ترین تگ‌های مورد استفاده است که در آن 6-10 هیستیدین به پایانه آمینو یا کربوکسیل پروتئین اضافه می‌شود و پروتئین هدف با توانایی آن در اتصال محکم به ستون‌های کلات Ni2+ تحت شرایط عادی یا دناتوره‌کننده خالص می‌شود (به عنوان مثال، 8M اوره ترکیب شده با ezolulew و سپس imi) یون های نیکل در چاه های مهره).

معرف های آزمایشگاهی:

IPTG; LB متوسط;

بافر لیز: 20 میلی مولار تریس (7.9)، 500 میلی مولار NaCl، 10 میلی مولار ایمیدازول.

بافر شستشو: 20 میلی‌مولار تریس (7.9)، 500 میلی‌مولار NaCl، 20 میلی‌مولار ایمیدازول؛

بافر شستشو: 20 میلی‌مولار تریس (7.9)، 200 میلی‌مولار NaCl، 300 میلی‌مولار ایمیدازول ( غلظت ایمیدازول را می‌توان با توجه به راندمان شستشو تنظیم کرد ).

محلول دیالیز: 20 میلی مولار تریس (7.9)، 50 میلی مولار نمک طعام، 10 درصد گلیسرول.

محلول رنگ آمیزی Kaomas Brilliant Blue; محلول رنگ زدایی

ابزار:

Ni-NTA، شکن اولتراسونیک، ستون کروماتوگرافی، لوله های غلظت

1-ساخت پلاسمید بیان پروکاریوتی: PCR ژن هدف، هضم ناقل، بستن، تبدیل، انتخاب تک کلون برای تعیین توالی.

2، پلاسمید ساخته شده با موفقیت را به BL21(DE3) تبدیل کنید، یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید، و تک کلون را برای تکان دادن کوچک در طول شب انتخاب کنید.

3، القای کوچک برای یافتن بهترین شرایط القایی: یک شبه محلول باکتریایی تکان داده می شود 1:1000 تلقیح در 3 میلی لیتر LB، 37 ℃ تکان دادن 4-5 ساعت به محلول باکتریایی OD600 = 0.6-0.8، اضافه کردن غلظت های مختلف IPTG، کاهش دما با دمای 0.1-1 میلی متر است. تمدید شده، مانند 37 ℃ القاء شده 4-5 ساعت، 30 ℃ القاء شده 6 ساعت تا 8 ساعت، 16 ℃ القاء شده 16-20 ساعت، 16 درجه سانتیگراد القا شده 16-20 ساعت، دما کاهش می یابد، زمان تمدید می شود، مانند 37 ℃ القاء شده، مانند 37 ℃-5 ساعت القاء شده، 37 ℃ القاء شده، 4 ساعت القایی 16 درجه سانتیگراد القا شده 16-20 ساعت، دما کاهش می یابد. C به مدت 16-20 ساعت، شیره باکتری را قبل و بعد از القاء تحت شرایط مختلف القایی بگیرید، ژل را اجرا کنید، رنگ آمیزی کنید و نتایج القاء را مشاهده کنید. (به طور کلی، هرچه غلظت IPTG کمتر و دمای القایی کمتر باشد، بیان پروتئین هدف کندتر می شود، منجر به تا شدن صحیح پروتئین ها می شود، در نتیجه حلالیت آنها افزایش می یابد و تولید اجسام انکلوژن کاهش می یابد)

4. پس از یافتن مناسب ترین شرایط القایی، محلول باکتریایی 1:1000 را در 2 لیتر LB تلقیح کنید، در دمای 37 درجه سانتیگراد تکان دهید تا OD600 محلول باکتری = 0.6-0.8 باشد، 20 میکرولیتر از محلول باکتری را آسپیر کنید و بگذارید تا ژل در شرایط مناسب بیان شود. قبل از آزمایش، و 20 میکرولیتر از محلول باکتری را آسپیره کنید و بگذارید تا ژل اجرا شود (2).

5، مایع باکتری القا شده را خارج کنید، در 4000 گرم به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید.

6. مایع رویی را دور بیندازید، وزن کنید، 10 میلی لیتر بافر لیزیس (1:100 به اضافه بازدارنده پروتئاز) برای هر گرم باکتری اضافه کنید، دوباره معلق کنید، حدود 30 دقیقه روی یخ قرار دهید.

7. خرد کردن فشار: الکل را در هموژنایزر فشار بالا بریزید، دو بار با آب بشویید، یک بار از بافر Lysis برای تعادل استفاده کنید، مایع باکتریایی را اضافه کنید، فشار (فشار نباید از 800kpa تجاوز کند)، مایع باکتریایی بیش از سه تا پنج بار شفاف و چسبناک نباشد.

8. جمع آوری مایع باکتریایی خرد شده، 12000 گرم، سانتریفیوژ 4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه، جداسازی مایع رویی و رسوب، هر کدام 20 میکرولیتر نمونه (3) (4) برای اجرا ژل.

9-2 میلی لیتر Ni-NTA به ستون تصفیه اضافه شد تا اتانول فیلتر شود، با آب شسته شود و بافر Lysis اضافه شود تا ستون متعادل شود.

10، با لیز بافر Ni-NTA به مایع رویی اضافه شده، خوب مخلوط کنید، 4 درجه سانتیگراد انکوباسیون شیکر به مدت 2 ساعت.

11، مایع رویی از ستون در دمای 4 درجه سانتی گراد عبور داده شد و 20 میکرولیتر از فیلتر جمع آوری شد (5).

12، ستون را با 5 میلی لیتر بافر شستشو 3 بار بشویید، نمونه فیلتر را 20 میکرولیتر (6) جمع آوری کنید.

13، 1 میلی لیتر بافر شستشو را اضافه کنید، به مدت 5 دقیقه انکوبه کنید، مایع شوینده را جمع آوری کنید، 5 بار تکرار کنید، 5 میلی لیتر از شوینده را در همان لوله جمع آوری کنید، 20 میکرولیتر از نمونه را بگذارید (7).

14، نمونه‌های پروتئین منفرد به‌دست‌آمده در طول آزمایش اجرا شدند، با Caumas Brilliant Blue به مدت 1 ساعت رنگ‌آمیزی شدند و تا زمانی که رنگ آبی پس‌زمینه روشن‌تر شد و نوارهای پروتئینی شفاف قابل مشاهده بود، رنگ‌آمیزی شدند.

15. باندهای پروتئینی هر نمونه را با توجه به نتایج عملیات بعدی آنالیز کنید: اگر نمونه های پروتئین شسته شده در پروتئین بدون نوارهای هتروزیگوت یا نوارهای هتروزیگوت یا کمتر و کم عمق باشد، می توانند دیالیز و غلظت شوند، در صورتی که باندهای هتروزیگوت بیشتری نیاز به تخلیص و پس از تغلیظ مجدد دارند.

16- دیالیز: نمونه را به غشای دیالیز اضافه کنید، هر دو انتها را ببندید، دیالیز در دمای 4 درجه یک شبه.

17، غلظت: با توجه به اندازه وزن مولکولی نمونه، لوله غلظت مناسب 4 ℃ غلظت کم سرعت، غلظت اندازه گیری غلظت پروتئین، برچسب زدن، در نیتروژن مایع انجماد سریع، و سپس در یخچال -80 ℃ منجمد را انتخاب کنید.

شکل زیر یک نمودار کوفکشن خالص سازی میل پروتئین GFP را در شرایط آزمایشگاهی نشان می دهد و خلوص و غلظت پروتئین خالص شده به شدت افزایش می یابد.