Čištění proteinu    je proces zavádění sekvencí nukleových kyselin kódujících proteiny do hostitelských buněk prostřednictvím technik genetického inženýrství, což způsobuje, že jsou exprimovány ve velkém množství a poté je čištění in vitro pomocí vitro pomocí vhodných metod čištění získají proteiny s vysokou čistotou, aktivitou a výnosem . Systémy exprese proteinů lze rozdělit do prokaryotických systémů a eukaryotických systémů.

Principy a metody pro vyvolání exprese proteinu v prokaryotických systémech a čištění proteinů in vitro pomocí afinitní chromatografie jsou popsány níže.

1 、 Negativní regulace laktózového manipulátoru:

V nepřítomnosti laktózy je lac manipulátor ve stavu odstrašování, kdy sekvence I exprimuje protein odrazujícího LAC, aby se váže na O sekvenci, což zabraňuje vazbě RNA polymerázy na sekvenci P a inhibující iniciaci transkripce. Když je přítomna laktóza, laktóza vstupuje do buňky a je katalyzována β-galaktosidázou a převedena na izoktózu, která se váže na inhibiční protein, což způsobuje konformační změnu proteinu a vede k disociaci inhibičního proteinu ze sekvence O, čímž se iniciuje transkripci.

Isopropylthiogalaktosid (IPTG) působí stejným způsobem jako isogalaktóza a je extrémně silným induktorem, který není metabolizován bakteriemi a je velmi stabilní, a proto se široce používá v laboratořích.

2 、 Výběr kmene hostitele:

(1) BL21 je jedním z nejčastěji používaných kmenů pro prokaryotickou expresi, která je vhodná hlavně pro expresi netoxických proteinů s E. coli polymerázou, takže může být aplikována na expresi prokaryotických systémů pomocí E. coli rNA polymerázy, jako je TAC nebo TRC (EG PGEX, pmal plazmidy).

(2) BL21 (DE3) integruje genu T7 fágové RNA polymerázy do oblasti A phage DE3 na chromozomu kmene BL21, který může exprimovat jak polymerázu T7 RNA a E. coli RNA polymeráza , a lze jej použít pro expresi plasmidů, jako je PET série, pgex, pmal a tak ON.

3, Metody čištění proteinů:

(1) Gel filtration chromatography: according to the molecular size from the mixture to separate proteins, the shape of different proteins and the molecular size of the differences in the mixture through the gel filtration chromatography column containing filler particles, due to the molecular size of various proteins are different, the diffusion into the specific size of the aperture particles of the ability to vary, the larger the protein molecules will be the První, aby byl eluován z molekul, jsou menší o pozdější eluce.

(2) Chromatografie výměny iontu: Separace a čištění proteinu je založena na různých nábojích na povrchu proteinu, povrch proteinu je obvykle rovnoměrně nabitý a může být za určitých podmínek kombinován s kationtovou/aniontovou výměnou. Když se pH změní nebo se pro eluce používá pufr s postupně zvyšující se iontovou pevností, může být vázaná látka vyměněna s ionty v eluentu a eluována do roztoku. Vzhledem k tomu, že různé látky mají různé náboje a různé vazebné schopnosti ve sloupci iontové výměny, pořadí eluováno do řešení je také odlišné.

(3) Hydrofobní chromatografie: Pomocí hydrofobity proteinů budou hydrofobní zbytky vystaveny na povrchu proteinů po denaturace nebo v prostředí s vysokým solným prostředím, hydrofobní pobyty různých proteinů mají odlišné síly účinku s vysokou pevností na to, že se s vysokou pevností od sebe, s vysokou pevností, a to s vysokou pevností, a to s vysokým obsahem, a to s vysokou pevností na elionu na elionu, a to pomocí řádu na základě elionu na elionu na to, že je na základě řádu, a to, že je to podle řádu, a to podle toho, že je to podle řádu, a to podle toho, že je na základě účinku, a to, že je na základě nejsilnějšího kompontu, a to podle toho, že je to podle toho, že je to nejsilnější pevnou, a to s vysokou pevností od účinku s hydrofobními ligandy a je to nejmenší. nízké.

(4) Afinitní chromatografie: Specifický ligand proteinu, který má být purifikován (nebo označen na proteinu), je kovalentně připojen k molekule nosiče vhodnými chemickými metodami. Když je proteinová směs přidána do chromatografické kolony naplněné afinitním médiem, protein, který má být purifikován, je specificky vázán na ligand, zatímco ostatní proteiny nejsou vázány a odstraněny promytím a specificky vázaný protein lze eluován roztokem volného odpovídajícího ligandu. Specificky vázané proteiny mohou být eluovány roztokem obsahujícím volný odpovídající ligand.

4 、 Výběr štítků pro čištění proteinů:

Charakteristiky různých štítků jsou následující ↓

Čištění jeho značky: His-značka je jednou z nejčastěji používaných značek, kde se do amino nebo karboxylového terminálu proteinu přidává 6-10 hitidinu (např. Karboxylový konec a poté je eturován jeho konkurencí na vázání na vázání v nickolu).

Laboratorní činidla:

IPTG; LB médium;

Lýzní pufr: 20 mm Tris (7,9), 500 mm NaCl, 10 mM imidazolu;

Promývací pufr: 20 mm Tris (7,9), 500 mm NaCl, 20 mM imidazolu;

Eluční pufr: 20 mm Tris (7,9), 200 mm NaCl, 300 mm imidazol ( koncentrace imidazolu lze upravit podle eluce );

Dialyzní roztok: 20 mM Tris (7,9), 50 mM NaCl, 10% glycerol;

Kaomas brilantní modrý obarvení roztok; odbarvování roztoku

Nástroje:

Ni-NTA, ultrazvukový jistič, sloupec chromatografie, koncentrační trubice

1 、 Konstrukce prokaryotického expresního plazmidu: PCR cílového genu, vektorové trávení, ligace, transformace, výběr jediného klonu pro sekvenování;

2 、 Transformace úspěšně konstruovaného plazmidu na BL21 (DE3), inkubovaná při 37 ℃ přes noc a vyberte si jediný klon pro malé třepání přes noc;

3、Small induction to find out the best induction conditions: will be shaken overnight bacterial solution 1:1000 inoculation into 3mL LB, 37 ℃ shaking 4-5h to the bacterial solution OD600 = 0.6-0.8, add different concentrations of IPTG (0.1-1mM), different temperatures, with the lowering of the temperature, induction time is extended, such as 37 ℃ induced 4-5h, 30 ℃ Indukované 6H-8H, 16 ℃ indukované 16-20H, 16 ° C indukované 16-20H, teplota je snížena, doba je prodloužena, jako je 37 ℃ indukovaný 4-5h, 30 ℃ indukovaný 6H-8H, 16 ° C indukované 16-20h, teplota je snížena. C Po dobu 16-20 h, bakteriální SAP před a po indukci za různých indukčních podmínek, spusťte gel, skvrnu a pozorujte výsledky indukce; (Obecně řečeno, čím nižší je koncentrace IPTG a nižší indukční teplota, tím pomalejší exprese cílového proteinu, tím více přispívá ke správnému skládání proteinů, čímž se zvyšuje jejich rozpustnost a snižuje tvorbu inkluzních těl)

4、After finding the most suitable induction conditions, inoculate the bacterial solution 1:1000 into 2L of LB, shake at 37℃ until the OD600 of the bacterial solution=0.6-0.8, aspirate 20μL of the bacterial solution and leave it to run the gel (1), then induce the protein expression under the suitable induction conditions obtained in the pre-experiment, and aspirate 20μL of the bacterial solution a nechat to spustit gel (2);

5 、 Odstraňte indukovanou bakteriální kapalinu, odstředivá při 4000 g po dobu 15 minut při 4 ℃;

6 、 Zlikvidujte supernatant, vážte, přidejte 10ml lýzní pufr (1: 100 plus inhibitor proteázy) pro každý gram bakterií, resuspend, umístěte na led asi 30 minut;

7 、 Rozdrcení tlaku: Odkládejte alkohol ve vysokotlakém homogenizátoru, dvakrát opláchněte vodou, použijte lýzní pufr k vyvážení jednou, přidejte bakteriální kapalinu, tlak (tlak by neměl překročit 800 kPA), bakteriální kapalina po třikrát až pětkrát pro transparentní;

8 、 Sbírejte rozdrcenou bakteriální kapalinu, 12000g, 4 ℃ centrifugace po dobu 20 minut, supernatant a separaci sraženiny, každý si zachoval 20 μl vzorku (3) (4), aby byl spuštěn gel;

9、2ml Ni-NTA byl přidán do sloupce čištění, aby byl ethanol filtrován, propláchnut vodou a přidán lýzový pufr pro rovnováhu sloupce;

10 、 s resuspenzí lýzního pufru NI-NTA přidaného do supernatantu, dobře promíchejte, inkubace 4 ℃ Shaker pro 2H;

11 、 Supernatant prošel kolonou při 4 ° C a bylo odebráno 20 ul filtrátu (5);

12 、 Omyjte sloupec 5 ml promyté pufru 3krát, sbírejte vzorek filtrátu 20 μl (6);

13 、 Přidejte 1 ml eluční vyrovnávací paměti, inkubujte po dobu 5 minut, sbírejte eluát, opakujte 5krát, sbírejte 5 ml eluátu ve stejné trubici, ponechte 20 μl vzorku (7);

14 、 Jednotlivé proteinové vzorky získané v průběhu experimentu byly spuštěny, obarveny Caumas brilantní modrou po dobu 1H a odbarveny, dokud nebyla modrá barva na pozadí lehčí a byly vidět čiré proteinové pásy;

15 、 Analyzujte proteinové pásy každého vzorku podle výsledků následné operace: Pokud eluované proteinové vzorky v proteinu bez heterozygotních pásů nebo heterozygotních pásů nebo méně a mělkých, mohou být dialýza a koncentrace znovu vyčištěny po dialyzi a koncentraci.

16 、 Dialýza: Přidejte vzorek do dialyzační membrány, upíná oba konce, dialýzu při 4 ℃ přes noc;

17 、 Koncentrace: Podle velikosti molekulové hmotnosti vzorku pro zvolení vhodné koncentrace koncentrace 4 ℃ koncentrace nízké rychlosti, koncentrace měření koncentrace proteinu, značení, v rychlém zmrazení kapalného dusíku a poté zmrazeno v -80 ℃ lednici.

Níže uvedený obrázek ukazuje kofekce grafu GFP proteinové afinitní čištění in vitro a čistota a koncentrace purifikovaného proteinu se výrazně zvyšuje