Definiția și utilizarea markerului proteic
Marker proteic este un amestec de proteine cu greutate moleculară cunoscută, care este utilizat ca „rigle ” pentru a indica dimensiunea benzilor proteice.
In the process of Western Blot, the molecular weight marker is like a screw, although it is a small link, however, it is such a small detail that has a significant effect on the experimental results.The role of the marker is mainly used to indicate the molecular weight of the protein bands corresponding to the size of the molecular weight, and only if the standard amount of accurate and correct, the results of the experiments are convincing, in addition to protein Marker also shows whether the membrana este transfectată sau nu. În plus, arată, de asemenea, dacă transferul de membrană are succes sau nu, iar gradul de electroforeză a proteinei pe gel, etc. Prin urmare, alegerea markerului proteic potrivit este, de asemenea, una dintre condițiile necesare pentru succesul experimentelor Western Blot.
Clasificarea markerilor proteici
În general, markerii proteici cei mai utilizați sunt clasificați în markeri proteici care nu sunt pătate de pre-pătate și markeri proteici pre-colorați.
Este un premix al mai multor proteine cu greutate moleculară cunoscută și purificat, care este convenabil pentru compararea proteinelor de diferite dimensiuni. Markerul care nu este pătat nu este la fel de bun ca markerul pre-colorat, deoarece este complet invizibil în timpul electroforezei și poate fi indicat numai după colorarea proteinelor la sfârșitul electroforezei și nu poate fi utilizat ca referință în procesul experimental, care aparține tipului de „retSight ”. Cu toate acestea, întrucât proteina nu este însoțită de o moleculă de colorant sau o moleculă de marker, dimensiunea arătată este exact dimensiunea inițială a proteinei, deci este mai precisă și poate determina cu exactitate dimensiunea proteinei.
Markerul pre-amestecat are de obicei câteva benzi care dublează concentrația ca o indicație, deoarece cu cât sunt mai multe benzi, cu atât este mai rău să vă amintiți, cine știe care este acela! Este greu de numărat până când ochii tăi nu sunt estompate. Așadar, atunci când îi vedeți pe cele deosebit de concentrate, benzile de marcaj își vor aminti unde se află. Amintiți -vă însă, însă, benzile mai mici nu sunt la fel de ușor de văzut. În ceea ce privește selecția, desigur, cel mai bine este să alegeți cel puțin una dintre benzile care au dimensiuni similare cu proteina țintă, cu atât mai aproape cu atât mai bine.
Marker proteic pre-colorat este unele proteine purificate amestecate împreună prin cuplarea covalentă cu un colorant, care poate fi observată direct în timpul electroforezei sau transferului de membrană.
Markerii proteici pre-colorați sunt convenabili pentru experimentele noastre. Acest standard de greutate moleculară proteică ne poate ajuta să monitorizăm electroforeza și să estimăm mobilitatea în timpul și după electroforeză, precum și după transferul de membrană - de exemplu, dacă se știe că zona optimă de rezoluție pentru electroforeza verticală este de aproximativ 2/3 din calea prin gel, folosind un marker pre -pătat, este posibil să fie de exemplu Marker pre-colorat, puteți prezice când proteina țintă intră în zona de rezoluție optimă și opriți electroforeza pentru a obține efectul optim de rezoluție; De asemenea, puteți încheia electroforeza în timp dacă observați o anomalie în electroforeza markerului; În plus, puteți observa dacă proteina este transferată complet la membrană după transferul membranei în Western blot și puteți eticheta greutatea moleculară a proteinei de pe membrană, motiv pentru care atrage o mulțime de laboratoare pentru a cumpăra standardul proteic pre-colorat.
Este demn de remarcat faptul că markerul proteic pre -colorat este cuplat covalent cu colorantul, astfel încât caracteristicile migrației se pot schimba atunci când electroforedate în condiții tampon diferite, ceea ce poate duce la unele abateri, astfel încât nu este potrivit pentru localizarea precisă a proteinelor - cu toate acestea, în majoritatea cazurilor, benzile de pe markerul nu pot fi identice pentru proteina țintă și rezultatele obținând doar aceleași ca marker ca proteina țintă. Cu toate acestea, în cele mai multe cazuri, este posibil ca benzile de marcaj să nu fie exact aceleași cu proteina noastră țintă, iar ceea ce obținem este doar o dimensiune de referință în raport cu indicația markerului, iar în final, avem nevoie de Western pentru a-l caracteriza, așa că dacă nu este nevoie să distingem între benzi de dimensiuni similare, markerul pre-păstrat este încă foarte util, și poate fi utilizat și în combinație cu standardul de proteină nestinse.
Clasificarea markerului proteic prestabil
Markerul proteic pre-colorat este împărțit în: marker proteic pre-colorat monocrom și pre-colorat, pre-colorat, monocrom, va folosi de obicei unele dintre benzi pentru a dubla concentrația anumitor benzi pentru a aprofunda grosimea anumitor benzi pentru a sugera dimensiunea lor, astfel încât să putem memora și diferenția rapid între dimensiunea benzilor individuale. Markerii proteinei de culoare se disting prin diferite culori, care este și mai recunoscător. Mai mult decât atât, dacă un marker curcubeu colorat iese într -un experiment plictisitor de electroforeză, starea de spirit va fi mai fericită în acest moment!
În plus față de cele de mai sus, există câteva alte tipuri de markeri proteici pe piață: markeri proteici fluorescenți, markeri biotinilați, markeri proteici dezvoltați, etc.
În plus, markerii proteici sunt clasificați în greutate moleculară mare, greutate moleculară mică și greutate moleculară largă în funcție de gama moleculară. Markerii cu o greutate moleculară ridicată sunt adesea folosiți pentru proteinele mari cu greutate moleculară, în timp ce markerii de greutate moleculară mici sunt adesea folosiți pentru proteine mici sau chiar pentru unele peptide. Dacă luați în considerare întregul laborator, alegeți markeri de greutate moleculară largă, cu o distribuție mai uniformă a benzii, astfel încât proteinele dvs. să poată fi ușor judecate indiferent de intervalul în care se află.
Câteva probleme cu Marker
De exemplu, manualul de instrucțiuni listează 7 benzi, de fapt, este normal să se deruleze 6 benzi, s -ar putea ca timpul de rulare să nu fie suficient, dacă proteina dvs. nu este foarte mică, puteți aștepta ca frontul albastru de bromofenol să se scurgă din gel înainte de a opri aparatul de electroforeză, astfel încât să puteți avea 7 benzi. Uneori vor fi 5 benzi, dar atâta timp cât cele două benzi superioare și inferioare ale proteinei dvs. țintă pot fi epuizate, nu trebuie să fie 7 benzi.
În primul rând, gelul nu este apăsat
În al doilea rând, fluiditatea lipiciului de la marginea plăcii și centrul lipiciului poate fi diferită, nu există nicio modalitate de a face acest lucru, cu vâscozitatea și tensiunea de suprafață. Dacă o varietate de metode nu pot rezolva fenomenul de mai sus, producătorul personal de consultanță pentru a schimba un canal pe eșantion, alegeți o bandă lângă centrul benzii de înot pentru a alerga.
Efectul de margine, la marginea celor două benzi ale eșantionului va fi astfel. Puteți încerca o viteză mai lentă a electroforezei ......
Fie lipiciul nu este bine presat atunci când este pregătit, lipiciul nu este bine preparat, fie tensiunea electroforezei este prea mare, forța electroosmotică este puternică, sau placa de sticlă nu este bine fixată în timpul electroforezei, iar soluția de electroforeză interioară se scurge, vă rugăm să le verificați una câte una.
Cauza 1: Volumul eșantionului este prea mare, volumul eșantionului trebuie redus.
Contramăsură: Volumul eșantionului trebuie controlat flexibil în funcție de concentrația eșantionului și grosimea gelului. În general, volumul eșantionului este de 10-15 µl (adică 2-10 μg de proteine). Dacă eșantionul este foarte diluat, volumul eșantionului poate ajunge la 100 µl.
Cauza 2: dizolvarea incompletă a eșantionului.
Contramăsuri:
(1) Eșantionul trebuie să fie dizolvat complet: păstrați tot felul de probe de proteine, iar markerul poate fi dizolvat complet înainte de prelevare, este mai bine să centrifugeți eșantionul înainte de prelevare și să eliminați particulele care nu pot fi dizolvate.
(2) soluția de dizolvare a eșantionului poate fi adăugată în funcție de cerințele kiturilor proteice pentru standardele de greutate moleculară; Dacă eșantioanele standard și necunoscute sunt autoconfigurate, urmați 0,5-1,0 mg/L soluție de dizolvare a eșantionului. After dissolution, transfer it to Ep tube, put the cap on (you can add a clip at the cap) and then heat it in a water bath at 110 degrees Celsius for 3 minutes (you can drill several round holes with the same diameter as the Ep tube in the thin Styrofoam plate, and the Ep tube is put down until the edge of the cap is constrained from going down any further, and then put the thin Styrofoam plate, which is exposing most of the body of Tubul EP, în baia de apă clocotită și placa subțire de styrofoam plutește în mod natural în baia de apă clocotită.
Un lot de tuburi EP poate fi plasat în baia de apă clocotită pentru diferite momente. (Nu aruncați tuburile EP în baia de apă clocotită, capacele pot fi spălate) și apoi se răcesc la temperatura camerei pentru utilizare. Dacă eșantionul nu este utilizat pentru o perioadă mai lungă de timp, depozitați eșantionul la un frigider la -20 grade Celsius, iar atunci când este nevoie, încălziți proba în apă clocotită la 110 grade Celsius timp de 3 minute la temperatura camerei și răciți -o înainte de a -l îndepărta pentru utilizare și apoi aplicarea eșantionului pentru a îndepărta agregatele substanțiale din proteinele de probă.
(3) Schimbați soluția de tampon de probă, astfel încât eșantionul să poată fi dizolvat complet și cantitatea de SDS să fie suficientă.
Motiv: benzile SDS sunt legate electroforetic de proteinele vecine. În plus față de eșantionarea excesivă și dizolvarea incompletă a eșantionului, scurgerea puțurilor de probă ale gelului poate determina lărgirea benzilor electroforetice. Scurgerea este adesea cauzată de fisuri între gel și placa de sticlă. Contramăsuri: În acest moment, gelul poate fi re-pregătit doar, pieptene ar trebui să fie atentă atunci când trageți coeziunea gelului este finalizată, viteza nu ar trebui să fie prea rapidă, direcția de tragere ar trebui să fie perpendiculară pe suprafața gelului; Pentru a evita fisurile dintre placa de sticlă de pe ambele părți ale gelului și gel, nu strângeți placa de sticlă pe ambele părți ale gelului în procesul de preparare a gelului.
