Definiția și utilizarea markerului proteic
Protein Marker este un amestec de proteine cu greutate moleculară cunoscută, care este folosit ca „riglă” pentru a indica dimensiunea benzilor de proteine.
În procesul de Western Blot, markerul de greutate moleculară este ca un șurub, deși este o legătură mică, cu toate acestea, este un detaliu atât de mic care are un efect semnificativ asupra rezultatelor experimentale. Rolul markerului este utilizat în principal pentru a indica greutatea moleculară a benzilor de proteine corespunzătoare mărimii greutății moleculare și numai dacă cantitatea standard de exactă și corectă, rezultatele experimentelor arată, de asemenea, dacă Markerul transfectează sau nu este convingător la proteine. În plus, arată, de asemenea, dacă transferul membranei este reușit sau nu, și gradul de electroforeză a proteinei pe gel etc. Prin urmare, alegerea markerului proteic potrivit este și una dintre condițiile necesare pentru succesul experimentelor Western Blot.
Clasificarea markerilor proteici
În general, cei mai des utilizați markeri proteici sunt clasificați în markeri proteici neprecolorați și markeri proteici precolorați.
Este un premix de mai multe proteine cu greutate moleculară cunoscută și purificate, ceea ce este convenabil pentru compararea proteinelor de diferite dimensiuni. Markerul neprecolorat nu este la fel de bun ca Markerul precolorat deoarece este complet invizibil în timpul electroforezei și poate fi indicat numai după colorarea proteinei la sfârșitul electroforezei și nu poate fi folosit ca referință în procesul experimental, care aparține tipului de „retrospectie”. Cu toate acestea, deoarece proteina nu este însoțită de o moleculă de colorant sau de o moleculă marker, dimensiunea afișată este exact dimensiunea inițială a proteinei, deci este mai precisă și poate determina cu exactitate dimensiunea proteinei.
Markerul pre-amestecat are de obicei câteva benzi care dublează concentrația ca indicație, pentru că cu cât sunt mai multe benzi amestecate, cu atât mai rău este de reținut, cine știe care este aceea! Este greu de numărat până când ochii îți sunt încețoșați. Deci, când le vedeți pe cele deosebit de concentrate, benzile de marcare își vor aminti unde sunt. Amintiți-vă, totuși, benzile mai mici nu sunt de obicei la fel de ușor de văzut. În ceea ce privește selecția, desigur, cel mai bine este să alegeți cel puțin una dintre benzile care este similară ca dimensiune cu proteina țintă, cu cât mai aproape, cu atât mai bine.
Markerul proteic precolorat este niște proteine purificate amestecate prin cuplare covalentă cu un colorant, care pot fi observate direct în timpul electroforezei sau transferului membranar.
Markerii de proteine pre-colorați sunt convenabil pentru experimentele noastre. Acest standard de greutate moleculară proteică ne poate ajuta să monitorizăm electroforeza și să estimăm mobilitatea în timpul și după electroforeză, precum și după transferul membranei - de exemplu, dacă se știe că zona optimă de rezoluție pentru electroforeza verticală este de aproximativ 2/3 din drumul prin gel, folosind un Marker pre-colorat, este posibil să. poate prezice când proteina țintă intră în zona de rezoluție optimă și poate opri electroforeza pentru a obține efectul de rezoluție optimă; de asemenea, puteți termina electroforeza la timp dacă observați o anomalie în electroforeza Markerului; în plus, puteți observa dacă proteina este transferată complet pe membrană după transferul membranei în Western Blot și puteți eticheta greutatea moleculară a proteinei pe membrană, motiv pentru care atrage o mulțime de laboratoare să cumpere standardul proteic pre-colorat.
Este de remarcat faptul că markerul de proteină pre-colorat este cuplat covalent cu colorantul, astfel încât caracteristicile de migrare se pot schimba atunci când sunt electroforeze în diferite condiții tampon, ceea ce poate duce la unele abateri, deci nu este potrivit pentru localizarea precisă a proteinelor - cu toate acestea, în cele mai multe cazuri, benzile de pe marker pot să nu fie identice cu proteina țintă și aceleași rezultate pe care le obținem sunt doar proteinele țintă. Cu toate acestea, în cele mai multe cazuri, benzile Marker s-ar putea să nu fie exact aceleași cu proteina noastră țintă și ceea ce obținem este doar o dimensiune de referință în raport cu indicația Marker și, în cele din urmă, avem nevoie de Western să o caracterizeze, așa că dacă nu trebuie să facem distincție între benzi de dimensiuni similare, Markerul pre-colorat este încă foarte util și poate fi, de asemenea, utilizat împreună cu standardul de proteine uns.
Clasificarea Markerului Protein Prestained
Markerul de proteine pre-colorat este împărțit în: monocrom pre-colorat și multi-color pre-colorat, monocrom pre-colorat protein Marker va folosi de obicei unele dintre benzi pentru a dubla concentrația anumitor benzi pentru a adânci grosimea anumitor benzi pentru a sugera dimensiunea dimensiunii lor, astfel încât să putem memora și diferenția rapid dimensiunea benzilor individuale. Markerii de proteine de culoare se disting prin culori diferite, ceea ce este și mai ușor de recunoscut. Mai mult, dacă un marker colorat curcubeu iese într-un experiment de electroforeză plictisitor, starea de spirit va fi mai fericită în acest moment!
Pe lângă cele de mai sus, pe piață există și alte tipuri de Markeri proteici: Markeri fluorescenți pentru proteine, Markeri biotinilați, Markeri proteici dezvoltați etc...
În plus, markerii de proteine sunt clasificați în greutate moleculară mare, greutate moleculară mică și greutate moleculară largă în funcție de intervalul de greutate moleculară. Markerii cu greutate moleculară mare sunt adesea utilizați pentru proteinele cu greutate moleculară mare, în timp ce markerii cu greutate moleculară mică sunt adesea utilizați pentru proteine mici sau chiar unele peptide. dacă luați în considerare întregul laborator, alegeți markeri cu greutate moleculară largă cu distribuție mai uniformă a benzilor, astfel încât proteinele dvs. să poată fi judecate cu ușurință indiferent de intervalul în care se află.
Câteva probleme cu Marker
De exemplu, manualul de instrucțiuni enumeră 7 benzi, de fapt, este normal să epuizezi 6 benzi, s-ar putea ca timpul de rulare să nu fie suficient, dacă proteina ta nu este foarte mică, poți aștepta ca fața albastră de bromofenol să se epuizeze din gel înainte de a opri aparatul de electroforeză, astfel încât să poți avea 7 benzi. Uneori vor fi 5 benzi, dar atâta timp cât cele două benzi superioare și inferioare ale proteinei țintă pot fi epuizate, nu trebuie să fie 7 benzi.
În primul rând, gelul nu este presat
În al doilea rând, fluiditatea adezivului la marginea plăcii și la centrul adezivului poate fi diferită, nu există nicio modalitate de a face acest lucru, cu vâscozitatea și tensiunea superficială. Dacă o varietate de metode nu poate rezolva fenomenul de mai sus, producătorul de sfaturi personale pentru a schimba un canal pe eșantion, alegeți o bandă în apropierea centrului benzii de înot pentru a alerga.
Efectul de margine, la marginea celor două benzi ale eșantionului va fi așa. Puteți încerca o viteză mai mică de electroforeză ......
Fie cleiul nu este bine presat atunci când este pregătit, cleiul nu este bine pregătit, fie tensiunea de electroforeză este prea mare, forța electroosmotică este puternică, fie placa de sticlă nu este bine prinsă în timpul electroforezei și soluția de electroforeză interioară curge, vă rugăm să le verificați unul câte unul.
Cauza 1: Volumul probei este prea mare, volumul probei ar trebui redus.
Contramăsuri: Volumul probei trebuie controlat flexibil în funcție de concentrația probei și grosimea gelului. În general, volumul probei este de 10-15μL (adică 2-10μg de proteină). Dacă proba este foarte diluată, volumul probei poate ajunge la 100μL.
Cauza 2: Dizolvarea incompletă a probei.
Contramăsuri:
(1) Proba ar trebui să fie complet dizolvată: păstrați toate tipurile de probe de proteine, iar Markerul poate fi complet dizolvat înainte de prelevare, este mai bine să centrifugeți proba înainte de prelevare și să îndepărtați particulele care nu pot fi dizolvate.
(2) Soluția de dizolvare a probei poate fi adăugată în conformitate cu cerințele truselor de proteine pentru standardele de greutate moleculară; dacă probele standard și necunoscute sunt auto-configurate, urmați soluția de dizolvare a probei de 0,5-1,0 mg/L. După dizolvare, transferați-l în tubul Ep, puneți capacul (puteți adăuga o clemă la capac) și apoi încălziți-l într-o baie de apă la 110 grade Celsius timp de 3 minute (puteți găuri mai multe găuri rotunde cu același diametru ca tubul Ep în placa subțire de polistiren, iar tubul Ep este pus jos până când capacul este coborât și mai departe, de la marginea, apoi este pusă în jos. Placa de polistiren, care expune cea mai mare parte a corpului tubului Ep, în baia de apă clocotită, și placa subțire de polistiren plutește în mod natural în baia de apă clocotită.
Un lot de tuburi Ep poate fi plasat în baia de apă clocotită pentru momente diferite. (Nu aruncați tuburile Ep în baia de apă clocotită, capacele pot fi spălate) și apoi răciți la temperatura camerei pentru utilizare. Dacă proba nu este folosită o perioadă mai lungă de timp, depozitați proba la frigider la -20 grade Celsius, iar când este necesar, încălziți proba în apă clocotită la 110 grade Celsius timp de 3 minute la temperatura camerei și răciți-o înainte de a o scoate pentru utilizare și apoi aplicați proba pentru a îndepărta agregatele substabile din proteinele eșantionului.
(3) Schimbați soluția tampon pentru probă astfel încât proba să poată fi dizolvată complet și cantitatea de SDS să fie suficientă.
Motiv: benzile SDS sunt legate electroforetic de proteinele învecinate. În plus față de supraeșantionarea și dizolvarea incompletă a probei, scurgerea godeurilor de probă ale gelului poate determina lărgirea benzilor electroforetice. Scurgerea este adesea cauzată de crăpăturile dintre gel și placa de sticlă. Contramăsuri: În acest moment, gelul poate fi doar re-pregătit, pieptene ar trebui să fie atent când tragerea în sus, coeziunea gelului este finalizată, viteza nu trebuie să fie prea mare, direcția de tragere în sus ar trebui să fie perpendiculară pe suprafața gelului; pentru a evita crăpăturile între placa de sticlă de pe ambele părți ale gelului și gel, nu strângeți placa de sticlă pe ambele părți ale gelului în procesul de preparare a gelului.
