प्रोटीन मार्कर की परिभाषा और उपयोग
प्रोटीन मार्कर ज्ञात आणविक भार के प्रोटीन का मिश्रण है, जिसका उपयोग प्रोटीन बैंड के आकार को इंगित करने के लिए 'रूलर' के रूप में किया जाता है।
वेस्टर्न ब्लॉट की प्रक्रिया में, आणविक भार मार्कर एक पेंच की तरह होता है, हालांकि यह एक छोटी सी कड़ी है, हालांकि, यह इतना छोटा विवरण है जो प्रयोगात्मक परिणामों पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालता है। मार्कर की भूमिका मुख्य रूप से आणविक भार के आकार के अनुरूप प्रोटीन बैंड के आणविक भार को इंगित करने के लिए उपयोग की जाती है, और केवल मानक मात्रा सटीक और सही होने पर ही प्रयोगों के परिणाम विश्वसनीय होते हैं, प्रोटीन के अलावा मार्कर यह भी दिखाता है कि झिल्ली ट्रांसफ़ेक्ट है या नहीं। इसके अलावा, यह यह भी दर्शाता है कि झिल्ली स्थानांतरण सफल है या नहीं, और जेल पर प्रोटीन के वैद्युतकणसंचलन की डिग्री आदि। इसलिए, सही प्रोटीन मार्कर चुनना भी वेस्टर्न ब्लॉट प्रयोगों की सफलता के लिए आवश्यक शर्तों में से एक है।
प्रोटीन मार्करों का वर्गीकरण
सामान्य तौर पर, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन मार्करों को गैर-पूर्व-दाग वाले प्रोटीन मार्करों और पूर्व-दाग वाले प्रोटीन मार्करों में वर्गीकृत किया जाता है।
यह ज्ञात आणविक भार और शुद्ध किए गए कई प्रोटीनों का प्रीमिक्स है, जो विभिन्न आकारों के प्रोटीन की तुलना के लिए सुविधाजनक है। गैर-पूर्व-दागदार मार्कर, पूर्व-दागदार मार्कर जितना अच्छा नहीं है क्योंकि यह वैद्युतकणसंचलन के दौरान पूरी तरह से अदृश्य है, और केवल वैद्युतकणसंचलन के अंत में प्रोटीन धुंधला होने के बाद संकेत दिया जा सकता है, और प्रयोगात्मक प्रक्रिया में एक संदर्भ के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है, जो 'पश्चदृष्टि' के प्रकार से संबंधित है। हालाँकि, चूंकि प्रोटीन के साथ डाई अणु या मार्कर अणु नहीं होता है, दिखाया गया आकार बिल्कुल प्रोटीन का मूल आकार है, इसलिए यह अधिक सटीक है और प्रोटीन के आकार को सटीक रूप से निर्धारित कर सकता है।
पूर्व-मिश्रित मार्कर में आमतौर पर एक संकेत के रूप में एकाग्रता को दोगुना करने वाले कुछ बैंड होते हैं, क्योंकि जितने अधिक बैंड मिश्रित होते हैं, यह याद रखना उतना ही बुरा होता है, कौन जानता है कि वह कौन सा है! जब तक आपकी आंखें धुंधली न हो जाएं, गिनना मुश्किल है। इसलिए जब आप विशेष रूप से केंद्रित बैंड देखेंगे तो मार्कर बैंड याद रखेंगे कि वे कहां हैं। हालाँकि, याद रखें, छोटे बैंड आमतौर पर देखने में उतने आसान नहीं होते हैं। चयन के संदर्भ में, निश्चित रूप से, कम से कम एक बैंड को चुनना सबसे अच्छा है जो आपके लक्ष्य प्रोटीन के आकार के समान है, जितना करीब उतना बेहतर।
प्री-स्टेन्ड प्रोटीन मार्कर कुछ शुद्ध प्रोटीन होते हैं जिन्हें एक डाई के साथ सहसंयोजक युग्मन द्वारा एक साथ मिलाया जाता है, जिसे सीधे इलेक्ट्रोफोरेसिस या झिल्ली स्थानांतरण के दौरान देखा जा सकता है।
पूर्व-दागदार प्रोटीन मार्कर हमारे प्रयोगों के लिए सुविधाजनक हैं। यह प्रोटीन आणविक भार मानक हमें वैद्युतकणसंचलन की निगरानी करने और वैद्युतकणसंचलन के दौरान और बाद में, साथ ही झिल्ली स्थानांतरण के बाद गतिशीलता का अनुमान लगाने में मदद कर सकता है - उदाहरण के लिए, यदि यह ज्ञात है कि ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन के लिए रिज़ॉल्यूशन का इष्टतम क्षेत्र जेल के माध्यम से लगभग 2/3 है, तो पूर्व-दाग मार्कर का उपयोग करना संभव है। उदाहरण के लिए, यह ज्ञात है कि ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन का इष्टतम रिज़ॉल्यूशन क्षेत्र जेल का लगभग 2/3 है, यदि आप पूर्व-दाग मार्कर का उपयोग करते हैं, तो आप अनुमान लगा सकते हैं कि लक्ष्य कब होगा प्रोटीन इष्टतम रिज़ॉल्यूशन क्षेत्र में प्रवेश करता है और इष्टतम रिज़ॉल्यूशन प्रभाव प्राप्त करने के लिए वैद्युतकणसंचलन को रोकता है; यदि आप मार्कर के वैद्युतकणसंचलन में कोई असामान्यता देखते हैं तो आप वैद्युतकणसंचलन को समय पर समाप्त भी कर सकते हैं; इसके अलावा, आप देख सकते हैं कि क्या वेस्टर्न ब्लॉट में झिल्ली के स्थानांतरण के बाद प्रोटीन पूरी तरह से झिल्ली में स्थानांतरित हो गया है और आप झिल्ली पर प्रोटीन के आणविक भार को लेबल कर सकते हैं, यही कारण है कि यह पूर्व-दाग प्रोटीन मानक खरीदने के लिए बहुत सारी प्रयोगशालाओं को आकर्षित करता है।
यह ध्यान देने योग्य है कि पूर्व-दाग प्रोटीन मार्कर को सहसंयोजक रूप से डाई के साथ जोड़ा जाता है, इसलिए विभिन्न बफर स्थितियों के तहत इलेक्ट्रोफोरेस्ड होने पर माइग्रेशन विशेषताएं बदल सकती हैं, जिससे कुछ विचलन हो सकते हैं, इसलिए यह प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण के लिए उपयुक्त नहीं है - हालांकि, ज्यादातर मामलों में, मार्कर पर बैंड लक्ष्य प्रोटीन के समान नहीं हो सकते हैं, और हमें जो परिणाम मिलते हैं वे लक्ष्य प्रोटीन के समान ही होते हैं। हालाँकि, ज्यादातर मामलों में, मार्कर बैंड हमारे लक्ष्य प्रोटीन के समान नहीं हो सकते हैं, और जो हमें मिलता है वह मार्कर संकेत के सापेक्ष केवल एक संदर्भ आकार होता है, और अंत में, हमें इसे चिह्नित करने के लिए पश्चिमी की आवश्यकता होती है, इसलिए यदि हमें समान आकार के बैंड के बीच अंतर करने की आवश्यकता नहीं है, तो पूर्व-दाग वाला मार्कर अभी भी बहुत उपयोगी है, और इसका उपयोग बिना दाग वाले प्रोटीन मानक के साथ संयोजन में भी किया जा सकता है।
प्रीस्टेड प्रोटीन मार्कर का वर्गीकरण
पूर्व-दाग प्रोटीन मार्कर को विभाजित किया गया है: मोनोक्रोम पूर्व-दाग और बहु-रंग पूर्व-दाग, मोनोक्रोम पूर्व-दाग प्रोटीन मार्कर आमतौर पर कुछ बैंड की मोटाई को गहरा करने के लिए कुछ बैंड की एकाग्रता को दोगुना करने के लिए उपयोग करेगा ताकि उनके आकार का सुझाव दिया जा सके, ताकि हम अलग-अलग बैंड के आकार को जल्दी से याद कर सकें और अंतर कर सकें। रंग प्रोटीन मार्करों को अलग-अलग रंगों से पहचाना जाता है, जो और भी अधिक पहचानने योग्य है। इसके अलावा, यदि एक नीरस वैद्युतकणसंचलन प्रयोग में एक रंगीन इंद्रधनुष मार्कर निकलता है, तो इस समय मूड अधिक खुश होगा!
उपरोक्त के अलावा, बाजार में कुछ अन्य प्रकार के प्रोटीन मार्कर भी हैं: फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर, बायोटिनाइलेटेड मार्कर, विकसित प्रोटीन मार्कर, आदि...
इसके अलावा, प्रोटीन मार्करों को आणविक भार सीमा के अनुसार उच्च आणविक भार, कम आणविक भार और व्यापक आणविक भार में वर्गीकृत किया जाता है। उच्च आणविक भार रेंज मार्करों का उपयोग अक्सर बड़े आणविक भार प्रोटीन के लिए किया जाता है, जबकि छोटे आणविक भार रेंज मार्करों का उपयोग अक्सर छोटे प्रोटीन या यहां तक कि कुछ पेप्टाइड्स के लिए किया जाता है। यदि आप पूरी प्रयोगशाला पर विचार करते हैं, तो अधिक समान बैंड वितरण वाले व्यापक आणविक भार मार्कर चुनें, ताकि आपके प्रोटीन का आसानी से आकलन किया जा सके, चाहे वे किसी भी अंतराल में हों।
मार्कर के साथ कुछ समस्याएं
उदाहरण के लिए, निर्देश मैनुअल में 7 बैंड सूचीबद्ध हैं, वास्तव में, 6 बैंड खत्म होना सामान्य है, ऐसा हो सकता है कि चलने का समय पर्याप्त नहीं है, यदि आपका प्रोटीन बहुत छोटा नहीं है, तो आप इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण को बंद करने से पहले ब्रोमोफेनॉल ब्लू फ्रंट जेल से बाहर निकलने का इंतजार कर सकते हैं, ताकि आप 7 बैंड चलाने में सक्षम हो सकें। कभी-कभी 5 बैंड होंगे, लेकिन जब तक आपके लक्ष्य प्रोटीन के ऊपरी और निचले दो बैंड समाप्त हो सकते हैं, तब तक 7 बैंड होने की आवश्यकता नहीं है।
सबसे पहले, जेल दबाया नहीं जाता है
दूसरे, प्लेट के किनारे और गोंद के केंद्र पर गोंद की तरलता भिन्न हो सकती है, चिपचिपाहट और सतह तनाव के साथ ऐसा करने का कोई तरीका नहीं है। यदि विभिन्न तरीकों से उपरोक्त घटना को हल नहीं किया जा सकता है, तो नमूने पर एक चैनल बदलने के लिए व्यक्तिगत सलाह निर्माता, एक रन चलाने के लिए स्विम लेन के केंद्र के पास एक लेन चुनें।
किनारे का प्रभाव, नमूने की दो लेन के किनारे पर इस प्रकार होगा। आप धीमी वैद्युतकणसंचलन गति का प्रयास कर सकते हैं......
या तो गोंद तैयार होने पर अच्छी तरह से दबाया नहीं गया है, गोंद अच्छी तरह से तैयार नहीं है, या वैद्युतकणसंचलन वोल्टेज बहुत अधिक है, इलेक्ट्रोस्मोटिक बल मजबूत है, या वैद्युतकणसंचलन के दौरान कांच की प्लेट अच्छी तरह से क्लैंप नहीं की गई है, और आंतरिक वैद्युतकणसंचलन समाधान लीक हो रहा है, कृपया उन्हें एक-एक करके जांचें।
कारण 1: नमूने की मात्रा बहुत अधिक है, नमूने की मात्रा कम की जानी चाहिए।
प्रतिउपाय: नमूना मात्रा को नमूना एकाग्रता और जेल मोटाई के अनुसार लचीले ढंग से नियंत्रित किया जाना चाहिए। आम तौर पर, नमूना मात्रा 10-15μL (यानी 2-10μg प्रोटीन) होती है। यदि नमूना बहुत पतला है, तो नमूना मात्रा 100μL तक पहुंच सकती है।
कारण 2: नमूने का अधूरा विघटन।
प्रतिउपाय:
(1) नमूना पूरी तरह से घुल जाना चाहिए: सभी प्रकार के प्रोटीन नमूने रखें और नमूना लेने से पहले मार्कर को पूरी तरह से भंग किया जा सकता है, नमूना लेने से पहले नमूने को सेंट्रीफ्यूज करना बेहतर होता है, और उन कणों को हटा दें जिन्हें भंग नहीं किया जा सकता है।
(2) आणविक भार मानकों के लिए प्रोटीन किट की आवश्यकताओं के अनुसार नमूना विघटन समाधान जोड़ा जा सकता है; यदि मानक और अज्ञात नमूने स्व-कॉन्फ़िगर हैं, तो 0.5-1.0mg/L नमूना विघटन समाधान का पालन करें। घुलने के बाद, इसे ईपी ट्यूब में स्थानांतरित करें, टोपी लगाएं (आप टोपी पर एक क्लिप लगा सकते हैं) और फिर इसे पानी के स्नान में 110 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए गर्म करें (आप पतली स्टायरोफोम प्लेट में ईपी ट्यूब के समान व्यास के साथ कई गोल छेद कर सकते हैं, और ईपी ट्यूब को तब तक नीचे रखा जाता है जब तक कि टोपी का किनारा और नीचे जाने से बाधित न हो जाए, और फिर पतली स्टायरोफोम प्लेट रखें, जो शरीर के अधिकांश भाग को उजागर कर रही है) ईपी ट्यूब, उबलते पानी के स्नान में, और पतली स्टायरोफोम प्लेट उबलते पानी के स्नान में स्वाभाविक रूप से तैरती है, पतली स्टायरोफोम शीट स्वाभाविक रूप से उबलते पानी की सतह पर तैरती है, जिससे उस तक पहुंच और गर्मी आसान हो जाती है, और उबलते पानी के छींटों से बचा जा सकता है।
ईपी ट्यूबों के एक बैच को अलग-अलग समय के लिए उबलते पानी के स्नान में रखा जा सकता है। (ईपी ट्यूबों को उबलते पानी के स्नान में न फेंकें, ढक्कन धुल सकते हैं) और फिर उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें। यदि लंबे समय तक नमूने का उपयोग नहीं किया जाता है, तो नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत करें, और जब आवश्यक हो, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर उबलते पानी में नमूना गर्म करें और इसे उपयोग के लिए हटाने से पहले ठंडा करें और फिर नमूना प्रोटीन में उप-स्थिर समुच्चय को हटाने के लिए नमूना लगाएं।
(3) नमूना बफर समाधान बदलें ताकि नमूना पूरी तरह से भंग हो सके और एसडीएस की मात्रा पर्याप्त होनी चाहिए।
कारण: एसडीएस बैंड इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से पड़ोसी प्रोटीन से जुड़े होते हैं। नमूने के अति-नमूनाकरण और अपूर्ण विघटन के अलावा, जेल के नमूना कुओं के रिसाव से इलेक्ट्रोफोरेटिक बैंड चौड़ा हो सकता है। रिसाव अक्सर जेल और ग्लास प्लेट के बीच दरार के कारण होता है। प्रतिउपाय: इस समय, जेल को केवल फिर से तैयार किया जा सकता है, जेल सामंजस्य पूरा होने पर कंघी को सावधान रहना चाहिए, गति बहुत तेज नहीं होनी चाहिए, ऊपर खींचने की दिशा जेल की सतह के लंबवत होनी चाहिए; जेल और जेल के दोनों तरफ की कांच की प्लेट के बीच दरारों से बचने के लिए, जेल तैयार करने की प्रक्रिया में जेल के दोनों तरफ की कांच की प्लेट को न निचोड़ें।
