प्रोटीन मार्कर | कैसे चुनें | समस्या विश्लेषण

प्रोटीन मार्कर परिभाषा और उपयोग

प्रोटीन मार्कर ज्ञात आणविक भार के प्रोटीन का मिश्रण है, जिसका उपयोग प्रोटीन बैंड के आकार को इंगित करने के लिए एक 'शासक ' के रूप में किया जाता है।

पश्चिमी धब्बा की प्रक्रिया में, आणविक भार मार्कर एक स्क्रू की तरह होता है, हालांकि यह एक छोटी सी कड़ी है, हालांकि, यह एक ऐसा छोटा विवरण है जिसका प्रयोगात्मक परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। मार्कर की भूमिका मुख्य रूप से प्रोटीन बैंड के आणविक भार को इंगित करने के लिए उपयोग की जाती है, जो कि सटीक और सही के रूप में भी सही है, जो कि सही मात्रा में है, झिल्ली ट्रांसफ़ेक्ट या नहीं है। इसके अलावा, यह भी दिखाता है कि झिल्ली हस्तांतरण सफल है या नहीं, और जेल पर प्रोटीन के वैद्युतकणसंचलन की डिग्री, आदि, इसलिए, सही प्रोटीन मार्कर का चयन करना भी पश्चिमी धब्बा प्रयोगों की सफलता के लिए आवश्यक शर्तों में से एक है।

प्रोटीन मार्करों का वर्गीकरण

सामान्य तौर पर, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन मार्करों को गैर-पीआर-सना हुआ प्रोटीन मार्करों और पूर्व-सना हुआ प्रोटीन मार्करों में वर्गीकृत किया जाता है।

• गैर-सना हुआ प्रोटीन मार्कर

यह ज्ञात आणविक भार और शुद्ध के कई प्रोटीनों का एक प्रीमिक्स है, जो विभिन्न आकारों के प्रोटीन की तुलना के लिए सुविधाजनक है। गैर-पीआरई-सना हुआ मार्कर पूर्व-सना हुआ मार्कर जितना अच्छा नहीं है क्योंकि यह वैद्युतकणसंचलन के दौरान पूरी तरह से अदृश्य है, और केवल वैद्युतकणसंचलन के अंत में प्रोटीन धुंधला होने के बाद इंगित किया जा सकता है, और प्रयोगात्मक प्रक्रिया में एक संदर्भ के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है, जो कि 'हेंडसाइट ' के प्रकार से संबंधित है। हालांकि, चूंकि प्रोटीन एक डाई अणु या एक मार्कर अणु के साथ नहीं है, इसलिए दिखाया गया आकार प्रोटीन का मूल आकार है, इसलिए यह अधिक सटीक है और प्रोटीन के आकार को सटीक रूप से निर्धारित कर सकता है।

पूर्व-मिश्रित मार्कर में आमतौर पर एक संकेत के रूप में एकाग्रता को दोगुना करने वाले कुछ बैंड होते हैं, क्योंकि अधिक बैंड मिश्रित होते हैं, यह याद रखने के लिए और भी बदतर होता है, कौन जानता है कि कौन एक है! जब तक आपकी आँखें धुंधली न हों, तब तक गिनना मुश्किल है। इसलिए जब आप विशेष रूप से केंद्रित लोगों को देखते हैं तो मार्कर बैंड याद करेंगे कि वे कहां हैं। याद रखें, हालांकि, छोटे बैंड आमतौर पर देखने में आसान नहीं होते हैं। चयन के संदर्भ में, निश्चित रूप से, कम से कम एक बैंड को चुनना सबसे अच्छा है जो आपके लक्ष्य प्रोटीन के आकार के समान है, बेहतर के करीब।

• प्रतिष्ठित प्रोटीन मार्कर

पूर्व-सना हुआ प्रोटीन मार्कर कुछ शुद्ध प्रोटीन है जो एक डाई के साथ सहसंयोजक युग्मन द्वारा एक साथ मिलाया जाता है, जिसे सीधे वैद्युतकणसंचलन या झिल्ली हस्तांतरण के दौरान देखा जा सकता है।

पूर्व-सना हुआ प्रोटीन मार्कर हमारे प्रयोगों के लिए सुविधाजनक हैं। यह प्रोटीन आणविक भार मानक हमें वैद्युतकणसंचलन की निगरानी करने और इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान और साथ ही झिल्ली के बाद गतिशीलता का अनुमान लगाने में मदद कर सकता है, साथ ही झिल्ली हस्तांतरण के बाद - उदाहरण के लिए, यदि यह ज्ञात है कि ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन के लिए रिज़ॉल्यूशन का इष्टतम क्षेत्र जेल के माध्यम से 2/3 के बारे में है, तो यह एक पूर्व -दागदार मार्कर का उपयोग कर सकता है, यह एक पूर्व -दाग के लिए संभव है। पूर्व-सना हुआ मार्कर, आप यह अनुमान लगा सकते हैं कि लक्ष्य प्रोटीन इष्टतम रिज़ॉल्यूशन ज़ोन में प्रवेश करता है और इष्टतम संकल्प प्रभाव प्राप्त करने के लिए वैद्युतकणसंचलन को रोकता है; यदि आप मार्कर के वैद्युतकणसंचलन में एक असामान्यता का निरीक्षण करते हैं, तो आप समय में वैद्युतकणसंचलन को भी समाप्त कर सकते हैं; इसके अलावा, आप देख सकते हैं कि क्या प्रोटीन को पश्चिमी धब्बा में झिल्ली के हस्तांतरण के बाद पूरी तरह से झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है और आप झिल्ली पर प्रोटीन के आणविक भार को लेबल कर सकते हैं, यही कारण है कि यह पूर्व-सना हुआ प्रोटीन मानक खरीदने के लिए बहुत सारे प्रयोगशालाओं को आकर्षित करता है।

यह ध्यान देने योग्य है कि पूर्व -सना हुआ प्रोटीन मार्कर को डाई के साथ सहसंयोजक रूप से युग्मित किया जाता है, इसलिए माइग्रेशन विशेषताओं को अलग -अलग बफर परिस्थितियों में इलेक्ट्रोफोर्स होने पर बदल सकता है, जिससे कुछ विचलन हो सकते हैं, इसलिए यह प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण के लिए उपयुक्त नहीं है - हालांकि, ज्यादातर मामलों में, लक्ष्य प्रोटीन के लिए समान नहीं हो सकता है। हालांकि, ज्यादातर मामलों में, मार्कर बैंड हमारे लक्ष्य प्रोटीन के समान बिल्कुल नहीं हो सकते हैं, और हमें जो मिलता है वह मार्कर संकेत के सापेक्ष एक संदर्भ आकार है, और अंत में, हमें इसे चिह्नित करने के लिए पश्चिमी की आवश्यकता है, इसलिए यदि हमें समान आकारों के बैंड के बीच अंतर करने की आवश्यकता नहीं है, तो पूर्व-स्टेन्ड मार्कर अभी भी बहुत उपयोगी है, और यह अस्थिर प्रोटीन मानक के साथ भी उपयोग किया जा सकता है।

प्रतिष्ठित प्रोटीन मार्कर का वर्गीकरण

पूर्व-सना हुआ प्रोटीन मार्कर को विभाजित किया गया है: मोनोक्रोम प्री-स्टेन्ड और मल्टी-कलर प्री-स्टेन्ड, मोनोक्रोम प्री-स्टेन्ड प्रोटीन मार्कर आमतौर पर कुछ बैंडों का उपयोग कुछ बैंड की एकाग्रता को दोगुना करने के लिए करेगा, जो कुछ बैंड की मोटाई को उनके आकार के आकार का सुझाव देने के लिए गहराई से गहन करता है, ताकि हम जल्दी से याद कर सकें और अलग-अलग बैंड के बीच अलग हो सकें। रंग प्रोटीन मार्कर अलग -अलग रंगों द्वारा प्रतिष्ठित होते हैं, जो और भी अधिक पहचानने योग्य है। इसके अलावा, यदि एक रंगीन इंद्रधनुष मार्कर एक सुस्त वैद्युतकणसंचलन प्रयोग में बाहर आता है, तो इस समय मूड खुश हो जाएगा!

उपरोक्त के अलावा, बाजार पर कुछ अन्य प्रकार के प्रोटीन मार्कर हैं: फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर, बायोटिनाइलेटेड मार्कर, विकसित प्रोटीन मार्कर, आदि ...।

इसके अलावा, प्रोटीन मार्करों को आणविक भार सीमा के अनुसार उच्च आणविक भार, कम आणविक भार और व्यापक आणविक भार में वर्गीकृत किया जाता है। उच्च आणविक भार रेंज मार्कर अक्सर बड़े आणविक भार प्रोटीन के लिए उपयोग किए जाते हैं, जबकि छोटे आणविक भार रेंज मार्कर अक्सर छोटे प्रोटीन या यहां तक ​​कि कुछ पेप्टाइड्स के लिए उपयोग किए जाते हैं। यदि आप पूरी प्रयोगशाला पर विचार करते हैं, तो अधिक समान बैंड वितरण के साथ व्यापक आणविक भार मार्कर चुनें, ताकि आपके प्रोटीन को आसानी से आंका जा सके कि वे किस अंतराल में हैं।

मार्कर के साथ कुछ समस्याएं

• क्या सभी मार्करों को बाहर चलाना है?

उदाहरण के लिए, इंस्ट्रक्शन मैनुअल 7 बैंड को सूचीबद्ध करता है, वास्तव में, 6 बैंड को चलाना सामान्य है, यह हो सकता है कि रनिंग टाइम पर्याप्त नहीं है, यदि आपका प्रोटीन बहुत छोटा नहीं है, तो आप ब्रोमोफेनॉल ब्लू फ्रंट का इंतजार कर सकते हैं, जो कि वैद्युतकणसंचलन को बंद करने से पहले जेल से बाहर निकलने के लिए है, ताकि आप 7 बैंड रखने में सक्षम हों। कभी -कभी 5 बैंड होंगे, लेकिन जब तक आपके लक्ष्य प्रोटीन के ऊपरी और निचले दो बैंड को बाहर चलाया जा सकता है, तब तक 7 बैंड नहीं होने चाहिए।

• अगर मार्कर स्माइली चेहरे में बदल जाता है तो मुझे क्या करना चाहिए?

सबसे पहले, जेल को दबाया नहीं जाता है

दूसरे, प्लेट के किनारे पर गोंद की तरलता और गोंद का केंद्र अलग हो सकता है, ऐसा करने का कोई तरीका नहीं है, चिपचिपाहट और सतह के तनाव के साथ। यदि विभिन्न प्रकार के तरीके उपरोक्त घटना को हल नहीं कर सकते हैं, तो व्यक्तिगत सलाह निर्माता नमूने पर एक चैनल बदलने के लिए, एक रन चलाने के लिए तैराकी लेन के केंद्र के पास एक लेन चुनें।

नमूना के दो लेन के किनारे पर किनारे प्रभाव, इस तरह होगा। आप धीमी गति से इलेक्ट्रोफोरेसिस गति की कोशिश कर सकते हैं ......

या तो गोंद को अच्छी तरह से दबाया नहीं जाता है जब इसे तैयार किया जाता है, गोंद अच्छी तरह से तैयार नहीं होता है, या वैद्युतकणसंचलन वोल्टेज बहुत अधिक होता है, इलेक्ट्रोस्मोटिक बल मजबूत होता है, या ग्लास प्लेट इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान अच्छी तरह से क्लैंप नहीं होता है, और आंतरिक वैद्युतकणसंचलन समाधान लीक हो रहा है, कृपया उन्हें एक से जांचें।

• मार्कर बैंड के चौड़ीकरण की समस्या को कैसे हल करें?

कारण 1: नमूने की मात्रा बहुत अधिक है, नमूने की मात्रा कम होनी चाहिए।

काउंटरमेसर: नमूना मात्रा को नमूना एकाग्रता और जेल की मोटाई के अनुसार लचीले ढंग से नियंत्रित किया जाना चाहिए। आम तौर पर, नमूना मात्रा 10-15μl (यानी 2-10μg प्रोटीन) है। यदि नमूना बहुत पतला है, तो नमूना मात्रा 100μL तक पहुंच सकती है।

कारण 2: नमूने का अपूर्ण विघटन।

काउंटरमेशर्स:

(1) नमूना पूरी तरह से भंग हो जाना चाहिए: सभी प्रकार के प्रोटीन के नमूने रखें और नमूनाकरण से पहले मार्कर को पूरी तरह से भंग किया जा सकता है, नमूना लेने से पहले नमूने को अप करना बेहतर है, और उन कणों को हटाना जो भंग नहीं किया जा सकता है।

(2) आणविक भार मानकों के लिए प्रोटीन किट की आवश्यकताओं के अनुसार नमूना विघटन समाधान जोड़ा जा सकता है; यदि मानक और अज्ञात नमूने स्व-कॉन्फ़िगर किए जाते हैं, तो 0.5-1.0mg/l नमूना विघटन समाधान का पालन करें। विघटन के बाद, इसे ईपी ट्यूब में स्थानांतरित करें, कैप को डालें (आप कैप पर एक क्लिप जोड़ सकते हैं) और फिर इसे 3 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में गर्म करें (आप पतले स्टायरोफोम प्लेट में ईपी ट्यूब के साथ एक ही व्यास के साथ कई गोल छेद ड्रिल कर सकते हैं, जो कि नीचे की ओर गिरने से कम हो जाता है, ईपी ट्यूब का शरीर, उबलते पानी के स्नान में, और पतली स्टायरोफोम प्लेट स्वाभाविक रूप से उबलते पानी के स्नान में तैरती है।

ईपी ट्यूबों के एक बैच को अलग -अलग समय के लिए उबलते पानी के स्नान में रखा जा सकता है। (ईपी ट्यूबों को उबलते पानी के स्नान में न फेंकें, ढक्कन को धोया जा सकता है) और फिर उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें। यदि नमूना का उपयोग अधिक समय के लिए नहीं किया जाता है, तो नमूना को -20 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें, और जब आवश्यक हो, तो कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर उबलते पानी में नमूना को गर्म करें और इसे उपयोग के लिए इसे हटाने से पहले इसे ठंडा करें और फिर नमूना प्रोटीन में सबस्टेबल एग्रीगेट्स को हटाने के लिए नमूना लागू करें।

(3) नमूना बफर समाधान बदलें ताकि नमूना पूरी तरह से भंग हो सके और एसडीएस की मात्रा पर्याप्त होनी चाहिए।

कारण: एसडीएस बैंड इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से पड़ोसी प्रोटीन से जुड़े हैं। नमूने के ओवर-सैंपलिंग और अपूर्ण विघटन के अलावा, जेल के नमूना कुओं का रिसाव इलेक्ट्रोफोरेटिक बैंड को चौड़ा कर सकता है। रिसाव अक्सर जेल और कांच की प्लेट के बीच दरार के कारण होता है। काउंटरमेशर्स: इस समय, जेल को केवल फिर से तैयार किया जा सकता है, कंघी को सावधान रहना चाहिए जब जेल सामंजस्य पूरा हो जाता है, गति बहुत तेज नहीं होनी चाहिए, ऊपर खींचने की दिशा जेल की सतह के लिए लंबवत होनी चाहिए; जेल और जेल के दोनों किनारों पर कांच की प्लेट के बीच दरार से बचने के लिए, जेल की तैयारी की प्रक्रिया में जेल के दोनों किनारों पर कांच की प्लेट को निचोड़ें।