Definition und Verwendung von Proteinmarkern
Proteinmarker ist eine Mischung aus Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht, die als „Lineal“ zur Anzeige der Größe von Proteinbanden verwendet wird.
Im Western-Blot-Prozess ist der Molekulargewichtsmarker wie eine Schraube, obwohl es sich um ein kleines Glied handelt, ist es jedoch ein so kleines Detail, das einen erheblichen Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse hat. Die Rolle des Markers wird hauptsächlich verwendet, um das Molekulargewicht der Proteinbanden anzuzeigen, die der Größe des Molekulargewichts entsprechen. Darüber hinaus wird auch angezeigt, ob der Membrantransfer erfolgreich ist oder nicht, sowie der Grad der Elektrophorese des Proteins auf dem Gel usw. Daher ist die Wahl des richtigen Proteinmarkers auch eine der notwendigen Voraussetzungen für den Erfolg von Western-Blot-Experimenten.
Klassifizierung von Proteinmarkern
Im Allgemeinen werden die am häufigsten verwendeten Proteinmarker in nicht vorgefärbte Proteinmarker und vorgefärbte Proteinmarker eingeteilt.
Es handelt sich um eine Vormischung mehrerer Proteine mit bekanntem Molekulargewicht und gereinigter Form, die für den Vergleich von Proteinen unterschiedlicher Größe geeignet ist. Nicht vorgefärbter Marker ist nicht so gut wie vorgefärbter Marker, da er während der Elektrophorese völlig unsichtbar ist und erst nach der Proteinfärbung am Ende der Elektrophorese angezeigt werden kann und nicht als Referenz im experimentellen Prozess verwendet werden kann, der zum Typ „Rückblick“ gehört. Da das Protein jedoch nicht von einem Farbstoffmolekül oder Markermolekül begleitet wird, entspricht die angezeigte Größe genau der ursprünglichen Größe des Proteins, sodass sie genauer ist und die Größe des Proteins genau bestimmen kann.
Bei vorgemischten Markern gibt es normalerweise ein paar Streifen, die die Konzentration verdoppeln, denn je mehr Streifen gemischt werden, desto schlechter ist es, sich daran zu erinnern, wer weiß, welches das ist! Es ist schwer zu zählen, bis die Augen verschwimmen. Wenn Sie also die besonders konzentrierten Exemplare sehen, merken sich die Markierungsbänder, wo sie sich befinden. Bedenken Sie jedoch, dass die kleineren Bänder normalerweise nicht so leicht zu erkennen sind. Was die Auswahl angeht, ist es natürlich am besten, mindestens eine der Banden auszuwählen, die in ihrer Größe Ihrem Zielprotein ähnelt, je näher, desto besser.
Bei einem vorgefärbten Proteinmarker handelt es sich um einige gereinigte Proteine, die durch kovalente Kopplung mit einem Farbstoff zusammengemischt werden und direkt während der Elektrophorese oder des Membrantransfers beobachtet werden können.
Für unsere Experimente sind vorgefärbte Proteinmarker praktisch. Dieser Protein-Molekulargewichtsstandard kann uns dabei helfen, die Elektrophorese zu überwachen und die Mobilität während und nach der Elektrophorese sowie nach dem Membrantransfer abzuschätzen. Wenn beispielsweise bekannt ist, dass die optimale Auflösungszone für die vertikale Elektrophorese etwa 2/3 des Weges durch das Gel beträgt, ist dies mit einem vorgefärbten Marker möglich. Beispielsweise ist bekannt, dass die optimale Auflösungszone der vertikalen Elektrophorese etwa 2/3 des Gels beträgt. Wenn Sie einen vorgefärbten Marker verwenden, können Sie vorhersagen, wann das Zielprotein eintritt Gehen Sie in die optimale Auflösungszone und stoppen Sie die Elektrophorese, um den optimalen Auflösungseffekt zu erzielen. Sie können die Elektrophorese auch rechtzeitig beenden, wenn Sie eine Anomalie in der Elektrophorese des Markers feststellen; Darüber hinaus können Sie beobachten, ob das Protein nach dem Membrantransfer im Western Blot vollständig auf die Membran übertragen wird, und Sie können das Molekulargewicht des Proteins auf der Membran markieren, weshalb es viele Labore dazu verleitet, den vorgefärbten Proteinstandard zu kaufen.
Es ist zu beachten, dass der vorgefärbte Proteinmarker kovalent mit dem Farbstoff gekoppelt ist, sodass sich die Migrationseigenschaften bei der Elektrophorese unter unterschiedlichen Pufferbedingungen ändern können, was zu einigen Abweichungen führen kann. Daher ist er nicht für die genaue Lokalisierung von Proteinen geeignet. In den meisten Fällen sind die Banden auf dem Marker jedoch möglicherweise nicht mit dem Zielprotein identisch und die Ergebnisse, die wir erhalten, sind genau die gleichen wie die des Zielproteins. Allerdings stimmen die Markerbanden in den meisten Fällen möglicherweise nicht genau mit denen unseres Zielproteins überein, und was wir erhalten, ist nur eine Referenzgröße relativ zur Markerangabe, und am Ende benötigen wir Western, um sie zu charakterisieren. Wenn wir also nicht zwischen Banden ähnlicher Größe unterscheiden müssen, ist der vorgefärbte Marker immer noch sehr nützlich und kann auch in Verbindung mit dem ungefärbten Proteinstandard verwendet werden.
Klassifizierung vorgefärbter Proteinmarker
Der vorgefärbte Proteinmarker ist unterteilt in: monochromer vorgefärbter und mehrfarbiger vorgefärbter. Der monochrome vorgefärbte Proteinmarker verwendet normalerweise einige der Banden, um die Konzentration bestimmter Banden zu verdoppeln, um die Dicke bestimmter Banden zu vertiefen, um die Größe ihrer Größe anzuzeigen, sodass wir uns die Größe der einzelnen Banden schnell merken und unterscheiden können. Farbproteinmarker zeichnen sich durch unterschiedliche Farben aus, was den Wiedererkennungswert erhöht. Wenn außerdem bei einem langweiligen Elektrophorese-Experiment ein bunter Regenbogenmarker herauskommt, ist die Stimmung zu diesem Zeitpunkt fröhlicher!
Zusätzlich zu den oben genannten gibt es noch einige andere Arten von Proteinmarkern auf dem Markt: fluoreszierende Proteinmarker, biotinylierte Marker, entwickelte Proteinmarker usw.
Darüber hinaus werden Proteinmarker je nach Molekulargewichtsbereich in hochmolekulare, niedermolekulare und breite Molekulargewichte eingeteilt. Marker mit hohem Molekulargewicht werden oft für Proteine mit großem Molekulargewicht verwendet, während Marker mit kleinem Molekulargewicht oft für kleine Proteine oder sogar einige Peptide verwendet werden. Wenn Sie das gesamte Labor in Betracht ziehen, wählen Sie Marker mit breitem Molekulargewicht und gleichmäßigerer Bandenverteilung, damit Ihre Proteine unabhängig vom Intervall, in dem sie sich befinden, leicht beurteilt werden können.
Einige Probleme mit Marker
In der Bedienungsanleitung sind beispielsweise 7 Banden aufgeführt. Tatsächlich ist es normal, dass 6 Banden ausgehen. Es kann sein, dass die Laufzeit nicht ausreicht. Wenn Ihr Protein nicht sehr klein ist, können Sie warten, bis die Bromphenolblau-Front aus dem Gel gelaufen ist, bevor Sie das Elektrophoresegerät ausschalten, sodass Sie 7 Banden haben sollten. Manchmal gibt es 5 Banden, aber solange die oberen und unteren beiden Banden Ihres Zielproteins ausgeschöpft werden können, müssen es nicht unbedingt 7 Banden sein.
Zunächst wird das Gel nicht gepresst
Zweitens kann die Fließfähigkeit des Klebers am Rand der Platte und in der Mitte des Klebers unterschiedlich sein, was mit der Viskosität und der Oberflächenspannung nicht möglich ist. Wenn eine Vielzahl von Methoden das oben genannte Phänomen nicht lösen kann, empfiehlt der persönliche Rat des Herstellers, einen Kanal in der Probe zu wechseln und eine Bahn in der Nähe der Mitte der Schwimmbahn auszuwählen, um einen Lauf auszuführen.
Der Kanteneffekt am Rand der beiden Spuren der Probe sieht folgendermaßen aus. Sie können eine langsamere Elektrophoresegeschwindigkeit ausprobieren ...
Entweder wird der Kleber bei der Vorbereitung nicht gut gepresst, der Kleber ist nicht gut vorbereitet, oder die Elektrophoresespannung ist zu hoch, die elektroosmotische Kraft ist stark, oder die Glasplatte ist während der Elektrophorese nicht gut festgeklemmt und die innere Elektrophoreselösung ist ausgelaufen. Bitte überprüfen Sie sie einzeln.
Ursache 1: Das Probenvolumen ist zu groß, das Probenvolumen sollte reduziert werden.
Gegenmaßnahme: Das Probenvolumen sollte je nach Probenkonzentration und Geldicke flexibel gesteuert werden. Im Allgemeinen beträgt das Probenvolumen 10–15 μL (dh 2–10 μg Protein). Wenn die Probe sehr verdünnt ist, kann das Probenvolumen 100 μL erreichen.
Ursache 2: Unvollständige Auflösung der Probe.
Gegenmaßnahmen:
(1) Die Probe sollte vollständig aufgelöst sein: Bewahren Sie alle Arten von Proteinproben auf, und Marker können vor der Probenahme vollständig aufgelöst werden. Es ist besser, die Probe vor der Probenahme zu zentrifugieren und die Partikel zu entfernen, die nicht aufgelöst werden können.
(2) Probenlösungslösung kann entsprechend den Anforderungen von Protein-Kits für Molekulargewichtsstandards hinzugefügt werden; Wenn die Standard- und unbekannten Proben selbstkonfiguriert sind, verwenden Sie eine Probenlösungslösung von 0,5–1,0 mg/L. Übertragen Sie es nach dem Auflösen in das Ep-Röhrchen, setzen Sie die Kappe auf (Sie können einen Clip an der Kappe anbringen) und erhitzen Sie es dann 3 Minuten lang in einem Wasserbad bei 110 Grad Celsius (Sie können mehrere runde Löcher mit dem gleichen Durchmesser wie das Ep-Röhrchen in die dünne Styroporplatte bohren, und das Ep-Röhrchen wird abgesetzt, bis der Rand der Kappe daran gehindert wird, weiter abzusinken, und dann wird die dünne Styroporplatte aufgesetzt, die den größten Teil des Körpers des Ep-Röhrchens freilegt. im kochenden Wasserbad, und die dünne Styroporplatte schwimmt auf natürliche Weise auf der Oberfläche des kochenden Wassers, was den Zugang und die Erwärmung erleichtert und ein Verspritzen des kochenden Wassers verhindert.
Eine Charge Ep-Röhrchen kann für unterschiedliche Zeiten in das kochende Wasserbad gelegt werden. (Werfen Sie die Ep-Röhrchen nicht in das kochende Wasserbad, die Deckel könnten abgewaschen werden) und lassen Sie sie dann zur Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen. Wenn die Probe über einen längeren Zeitraum nicht verwendet wird, lagern Sie die Probe im Kühlschrank bei -20 Grad Celsius. Erhitzen Sie die Probe bei Bedarf drei Minuten lang in kochendem Wasser bei 110 Grad Celsius bei Raumtemperatur und kühlen Sie sie ab, bevor Sie sie zur Verwendung entnehmen und dann die Probe auftragen, um die substabilen Aggregate in den Probenproteinen zu entfernen.
(3) Ändern Sie die Probenpufferlösung so, dass die Probe vollständig aufgelöst werden kann und die Menge an SDS ausreichend sein sollte.
Grund: SDS-Banden sind elektrophoretisch mit benachbarten Proteinen verknüpft. Zusätzlich zur Überbeprobung und unvollständigen Auflösung der Probe kann ein Auslaufen der Probenvertiefungen des Gels dazu führen, dass sich die elektrophoretischen Banden verbreitern. Ursache für die Leckage sind häufig Risse zwischen dem Gel und der Glasplatte. Gegenmaßnahmen: Zu diesem Zeitpunkt kann das Gel nur erneut vorbereitet werden. Der Kamm sollte vorsichtig sein, wenn der Zusammenhalt des Gels abgeschlossen ist. Die Geschwindigkeit sollte nicht zu hoch sein. Die Richtung des Hochziehens sollte senkrecht zur Oberfläche des Gels sein. Um Risse zwischen der Glasplatte auf beiden Seiten des Gels und dem Gel zu vermeiden, drücken Sie die Glasplatte auf beiden Seiten des Gels während der Gelvorbereitung nicht zusammen.
