Proteinmarker -Definition und -verwendung
Proteinmarker ist eine Mischung von Proteinen mit bekannter Molekulargewicht, das als 'Herrscher' verwendet wird, um die Größe der Proteinbanden anzuzeigen.
Im Prozess von Western Blot ist der Molekulargewichtsmarker wie eine Schraube, obwohl es sich um ein kleines Glied handelt. Es ist jedoch ein so kleines Detail, dass ein signifikanter Effekt auf die experimentellen Ergebnisse hat. Die Rolle des Markers wird hauptsächlich verwendet, um das Molekulardgewicht der Molekulargewicht der Proteinbanden zu zeigen, die der Größe entsprechen, und die Größe des Stoffmarks und der richtigen Stoffmarker und der Standardmarkierung. Membran wird transfiziert oder nicht. Darüber hinaus zeigt es auch, ob der Membrantransfer erfolgreich ist oder nicht, und der Grad der Elektrophorese des Proteins auf dem Gel usw. ist daher auch eine der notwendigen Bedingungen für den Erfolg von Western -Blot -Experimenten.
Klassifizierung von Proteinmarkern
Im Allgemeinen werden die am häufigsten verwendeten Proteinmarker in nicht-pre-gefärbte Proteinmarker und vorgefleckte Proteinmarker kategorisiert.
Es ist eine Vormischung mehrerer Proteine bekannter Molekulargewicht und gereinigt, was für den Vergleich von Proteinen unterschiedlicher Größen zweckmäßig ist. Nicht-PRE-Marker ist nicht so gut wie vor gefärbter Marker, da er während der Elektrophorese völlig unsichtbar ist und erst nach der Proteinfärbung am Ende der Elektrophorese angezeigt werden kann und nicht als Referenz im experimentellen Prozess verwendet werden kann, der zur Art von 'Nachhaltung' gehört. Da das Protein jedoch nicht von einem Farbstoffmolekül oder einem Markermolekül begleitet wird, ist die gezeigte Größe genau die ursprüngliche Größe des Proteins, so dass es genauer ist und die Größe des Proteins genau bestimmen kann.
Vorermischter Marker hat normalerweise ein paar Bänder, die die Konzentration als Hinweis verdoppeln, denn je mehr Bänder gemischt sind, desto schlimmer ist es, sich zu erinnern, wer weiß, welches das ist! Es ist schwer zu zählen, bis Ihre Augen verschwommen sind. Wenn Sie also die besonders konzentrierten sehen, erinnern sich die Markerbänder, wo sie sich befinden. Denken Sie jedoch daran, dass die kleineren Bänder normalerweise nicht so leicht zu sehen sind. In Bezug auf die Selektion ist es natürlich am besten, mindestens eine der Bänder zu wählen, die Ihrem Zielprotein ähnlich ist, desto besser desto besser.
Der vorgefärbte Proteinmarker ist einige gereinigte Proteine, die durch kovalente Kopplung mit einem Farbstoff gemischt werden, der direkt während der Elektrophorese oder der Membranübertragung beobachtet werden kann.
Vorgefleckte Proteinmarker sind für unsere Experimente bequem. Dieser Proteinmolekulargewichtsstandard kann uns helfen, die Elektrophorese zu überwachen und die Mobilität während und nach der Elektrophorese zu schätzen, sowie nach der Membranübertragung - wenn bekannt ist, dass die optimale Auflösungszone für vertikale Elektrophorese etwa 2/3 des Weges durch das Gel, unter Verwendung von vorgefärbtem Marker, ist es möglich. Ein vorgefärbter Marker können vorhersagen, wann das Zielprotein in die optimale Auflösungszone eintritt und die Elektrophorese stoppt, um den optimalen Auflösungseffekt zu erzielen. Sie können die Elektrophorese auch rechtzeitig beenden, wenn Sie eine Anomalie bei der Elektrophorese des Markers beobachten. Darüber hinaus können Sie beobachten, ob das Protein nach dem Transfer von Membran im Western Blot vollständig in die Membran übertragen wird, und Sie können das Molekulargewicht des Proteins auf der Membran kennzeichnen, weshalb es viele Laboratorien zum Kauf des vorgefärbten Proteinstandards anzieht.
Es ist erwähnenswert, dass der vorgefärbte Proteinmarker kovalent mit dem Farbstoff gekoppelt ist, sodass sich die Migrationseigenschaften bei elektrophoreser Weise unter verschiedenen Pufferbedingungen ändern können, was zu einigen Abweichungen führen kann. Daher ist er nicht für eine präzise Lokalisierung von Proteinen geeignet. In den meisten Fällen sind die Bänder jedoch möglicherweise nicht mit dem Zielprotein mit dem Zielprotein und dem Ziel. In den meisten Fällen sind die Markerbänder jedoch möglicherweise nicht genau das gleiche wie unser Zielprotein, und was wir erhalten, ist nur eine Referenzgröße in Bezug auf die Markierungsanzeige, und am Ende brauchen wir westlich, um sie zu charakterisieren. Wenn wir also nicht zwischen Banden ähnlicher Größen unterscheiden müssen, ist der vorgespiegelte Marker immer noch sehr nützlich und kann auch in Verbindung mit dem nicht mit dem nicht verwendeten Proteinstandard verwendet werden.
Klassifizierung des vorgerichteten Proteinmarkers
Der vorgefärbte Proteinmarker ist unterteilt in: monochrom vorgefärbter und mehrfarbiger, vorgefärbter, monochrom vorgefärbter Proteinmarker verwendet normalerweise einige der Banden, um die Konzentration bestimmter Bänder zu verdoppeln, um die Dicke bestimmter Bänder zu vertiefen, um die Größe ihrer Größe vorzuschlagen, damit wir uns schnell zwischen den einzelnen Banden merken und zwischen den einzelnen Bändern unterscheiden können. Farbproteinmarker werden durch verschiedene Farben unterschieden, was noch erkennbarer ist. Wenn ein farbenfroher Regenbogenmarker in einem stumpfe Elektrophorese -Experiment herauskommt, wird die Stimmung zu dieser Zeit glücklicher!
Darüber hinaus gibt es auf dem Markt einige andere Arten von Proteinmarkern: fluoreszierende Proteinmarker, biotinylierte Marker, entwickelte Proteinmarker usw.
Darüber hinaus werden Proteinmarker in hohem Molekulargewicht, niedrigem Molekulargewicht und breites Molekulargewicht gemäß dem Molekulargewichtsbereich kategorisiert. Marker mit hohem Molekulargewichtsbereich werden häufig für große Molekulargewichtsproteine verwendet, während Marker mit kleinem Molekulargewicht häufig für kleine Proteine oder sogar einige Peptide verwendet werden. Wenn Sie das gesamte Labor betrachten, wählen Sie breite Molekulargewichtsmarker mit gleichmäßigerer Bandverteilung, damit Ihre Proteine leicht beurteilt werden können, egal in welchem Intervall sie sich befinden.
Einige Probleme mit dem Marker
In der Bedienungsanleitung listet beispielsweise 7 Bänder auf. Tatsächlich ist es normal, 6 Bänder auszulaufen. Es kann sein, dass die Laufzeit nicht ausreicht. Wenn Ihr Protein nicht sehr klein ist, können Sie darauf warten, dass die Bromphenolblaue Front vor dem Gel aus dem Gel aus dem Gel aus dem Gel -Apparat ausgeschaltet wird, damit Sie 7 Bands ausschalten sollten. Manchmal gibt es 5 Bänder, aber solange die oberen und unteren zwei Bänder Ihres Zielproteins ausgeführt werden können, muss es nicht 7 Bänder sein.
Erstens wird das Gel nicht gedrückt
Zweitens kann die Fluidität des Klebstoffs am Rand der Platte und die Mitte des Klebstoffs unterschiedlich sein, es gibt keine Möglichkeit, dies mit der Viskosität und der Oberflächenspannung zu tun. Wenn eine Vielzahl von Methoden das obige Phänomen nicht lösen kann, wählt der persönliche Beratungshersteller einen Kanal auf der Probe, eine Spur in der Nähe der Mitte der Swim Lane, um einen Lauf zu betreiben.
Der Kanteneffekt am Rand der beiden Spuren der Probe wird so sein. Sie können eine langsamere Elektrophorese -Geschwindigkeit versuchen ......
Entweder ist der Kleber nicht gut gepresst, wenn er vorbereitet ist, der Kleber ist nicht gut vorbereitet, oder die Elektrophoresespannung ist zu hoch, die elektroosmotische Kraft ist stark, oder die Glasplatte ist nicht gut während der Elektrophorese geklemmt, und die innere Elektrophorese -Lösung ist undak, bitte überprüfen Sie sie einzeln.
Ursache 1: Das Probenvolumen ist zu stark, das Probenvolumen sollte reduziert werden.
Gegenmaßnahme: Das Probenvolumen sollte entsprechend der Probenkonzentration und der Geldicke flexibel gesteuert werden. Im Allgemeinen beträgt das Probenvolumen 10-15 & mgr; l (dh 2-10 μg Protein). Wenn die Probe sehr verdünnt ist, kann das Probenvolumen 100 μl erreichen.
Ursache 2: Unvollständige Auflösung der Probe.
Gegenmaßnahmen:
(1) Die Probe sollte vollständig gelöst werden: Halten Sie alle Arten von Proteinproben und der Marker kann vor der Probenahme vollständig gelöst werden. Es ist besser, die Probe vor der Probenahme zu zentrifizieren und die Partikel zu entfernen, die nicht gelöst werden können.
(2) Die Lösung der Probenauflösung kann gemäß den Anforderungen von Proteinkits für Molekulargewichtsstandards zugesetzt werden; Wenn die Standard- und unbekannten Proben selbstkonfiguriert sind, folgen Sie 0,5-1,0 mg/l Probenlösungslösung. Nach Auflösung übertragen Sie es in EP -Röhrchen, legen Sie die Kappe ein (Sie können einen Clip an der Kappe hinzufügen) und dann 3 Minuten in einem Wasserbad bei 110 Grad Celsius erhitzen (Sie können mehrere runde Löcher mit dem gleichen Durchmesser bohren, da der EP -Röhrchen in der dünnen Styroporplatte den größten Teil des Börsens abgebaut hat, bis der Körper die meiste Lösche abgesetzt wird, und das dünne Styrof -Abtast, und das dünne Styrof, und das dünne Styrof, und das dünne Styrof, das sich an die Kette befindet. der EP -Röhre, im kochenden Wasserbad, und die dünne Styroporplatte schwimmt natürlich im kochenden Wasserbad.
Für verschiedene Zeiten kann eine Menge EP -Röhrchen in das kochende Wasserbad gelegt werden. (Werfen Sie die EP -Röhrchen nicht in das kochende Wasserbad, die Deckel können abgewaschen werden.) Und dann bei Raumtemperatur zum Gebrauch abkühlen. Wenn die Probe für einen längeren Zeitraum nicht verwendet wird, lagern Sie die Probe in einem Kühlschrank bei -20 Grad Celsius und erhitzen Sie die Probe bei Bedarf in kochendem Wasser bei 110 Grad Celsius für 3 Minuten bei Raumtemperatur und kühlen Sie sie vor dem Entfernen der Verwendung und dann die Probe an, um die Substanzaggregate in den Probenproteinen zu entfernen.
(3) Ändern Sie die Probenpufferlösung so, dass die Probe vollständig gelöst werden kann und die Menge an SDS ausreichend sein sollte.
Grund: SDS -Bänder sind elektrophoretisch mit benachbarten Proteinen verbunden. Zusätzlich zur Überprüfung und unvollständigen Auflösung der Probe kann die Leckage der Probenbohrungen des Gels die elektrophoretischen Banden vergrößern. Die Leckage wird häufig durch Risse zwischen dem Gel und der Glasplatte verursacht. Gegenmaßnahmen: Zu diesem Zeitpunkt kann das Gel nur überbereitet werden, der Kamm sollte vorsichtig sein, wenn der Gel-Kohäsion nach oben gezogen wird. Die Geschwindigkeit sollte nicht zu schnell sein, die Richtung des Ziehens sollte senkrecht zur Oberfläche des Gels sein. Um Risse zwischen der Glasplatte auf beiden Seiten des Gels und des Gels zu vermeiden, drücken Sie die Glasplatte bei der Gelvorbereitung nicht auf beiden Seiten des Gels.
