タンパク質マーカー|選択する方法|問題分析

タンパク質マーカーの定義と使用

タンパク質マーカーは、既知の分子量のタンパク質の混合物であり、タンパク質バンドのサイズを示すために 'Ruler 'として使用されます。

ウエスタンブロットの過程で、分子量マーカーはネジのようなものですが、小さなリンクですが、実験結果に大きな効果があるのは非常に小さな詳細です。マーカーの役割は、主に分子量のサイズに対応するタンパク質バンドの分子量を示すために使用されます。膜はトランスフェクトされるかどうか。さらに、膜移動が成功しているかどうか、およびゲル上のタンパク質の電気泳動の程度なども示しています。

タンパク質マーカーの分類

一般に、最も一般的に使用されるタンパク質マーカーは、非PRE染色タンパク質マーカーと事前染色されたタンパク質マーカーに分類されます。

• 非PRE染色タンパク質マーカー

これは、既知の分子量と精製のいくつかのタンパク質のプレミックスであり、異なるサイズのタンパク質の比較に便利です。非PRE染色マーカーは、電気泳動中に完全に見えないため、事前に染色されたマーカーほど良くありません。また、電気泳動の終わりにタンパク質染色後にのみ示されるため、実験プロセスの参照として使用することはできません。ただし、タンパク質には色素分子やマーカー分子が伴わないため、表示されるサイズはタンパク質の元のサイズであるため、より正確でタンパク質のサイズを正確に決定できます。

事前に混合されたマーカーには、通常、濃度を倍増するいくつかのバンドがあります。なぜなら、より多くのバンドが混ざっているほど、それはどちらがそれがあるかを知っている人を覚えておくべきです！目がぼやけるまで数えるのは難しいです。したがって、特に濃縮されたものを見ると、マーカーバンドがどこにいるかを思い出します。ただし、小さなバンドは通常、簡単に見ることができないことを忘れないでください。選択に関しては、もちろん、ターゲットタンパク質とサイズが似ているバンドの少なくとも1つを選択することをお勧めします。

• 事前に覆われたタンパク質マーカー

事前に染色されたタンパク質マーカーは、共有結合カップリングと色素を混合することにより、いくつかの精製タンパク質であり、電気泳動または膜移動中に直接観察できます。

事前に染色されたタンパク質マーカーは、実験に便利です。このタンパク質分子量標準は、電気泳動の監視と電気泳動後、および電気泳動後のモビリティを推定するのに役立ちます。たとえば、垂直電気泳動の最適な解像度の最適なゾーンがゲルを通過する方法の約2/3であることが知られている場合、事前に染色されたマーカーを使用して、たとえば垂直解像度ゾーンについては、最適な解像度ゾーンについては知られていることが知られています。事前に染色されたマーカーを使用する場合、ターゲットタンパク質が最適な解像度ゾーンに入る時期を予測し、最適な解像度効果を得るために電気泳動を停止できます。マーカーの電気泳動で異常を観察する場合、電気泳動を時間内に終了することもできます。さらに、ウエスタンブロット内の膜の移動後にタンパク質が完全に膜に移動されるかどうかを観察でき、膜上のタンパク質の分子量を標識することができます。そのため、事前に染色されたタンパク質標準を購入するために多くの研究所を引き付けます。

事前に染色されたタンパク質マーカーが色素と共有結合しているため、異なる緩衝条件で電気泳動が発生すると移動特性が変化する可能性があることは注目に値します。ただし、ほとんどの場合、マーカーバンドはターゲットタンパク質とまったく同じではない場合があり、私たちが得るものはマーカーの表示と比較して参照サイズにすぎません。最終的には、それを特徴付けるために西洋が必要なので、同様のサイズのバンドを区別する必要がない場合は、事前に染み込んだマーカーがまだ有用であり、非存在しないタンパク質の標準にも組み合わせて使用​​できます。

事前に覆われたタンパク質マーカーの分類

事前に染色されたタンパク質マーカーは、以下に分割されます。モノクロは事前に染色され、多色の事前に染色されているモノクロ前染色タンパク質マーカーは、特定のバンドの濃度を2倍にしてサイズのサイズを示唆して、個々のバンドのサイズをすばやく記憶して区別することができます。カラータンパク質マーカーは、さまざまな色で区別されますが、これはさらに認識可能です。さらに、カラフルな虹色のマーカーが鈍い電気泳動実験で出てくると、この時点で気分が幸せになります！

上記に加えて、市場には他の種類のタンパク質マーカーがいくつかあります。蛍光タンパク質マーカー、ビオチン化マーカー、開発されたタンパク質マーカーなど。

さらに、タンパク質マーカーは、分子量範囲に応じて、高分子量、低分子量、広分子量に分類されます。高分子量範囲マーカーは、多くの場合、大きな分子量タンパク質に使用されますが、小分子量範囲マーカーは、小さなタンパク質またはいくつかのペプチドにさえ使用されることがよくあります。実験室全体を検討する場合は、より均一なバンド分布を備えた広範な分子量マーカーを選択して、タンパク質がどの間隔にあるかに関係なく簡単に判断できるようにします。

マーカーに関するいくつかの問題

• すべてのマーカーを使い果たす必要がありますか？

たとえば、取扱説明書には7つのバンドがリストされています。実際、6つのバンドを使い果たすのは普通です。実行時間は十分ではない可能性があります。タンパク質がそれほど小さくない場合、ブロモフェノールの青いフロントがジェルを使い果たすのを待つことができます。 5つのバンドがある場合がありますが、ターゲットタンパク質の上部と下の2つのバンドが使い果たされる限り、7つのバンドである必要はありません。

• マーカーがスマイリーフェイスに変わる場合はどうすればよいですか？

まず、ゲルは押されません

第二に、プレートの端と接着剤の中心にある接着剤の流動性は異なる場合がありますが、 粘度と表面張力でこれを行う方法はありません。さまざまな方法で上記の現象を解くことができない場合は、個人的なアドバイスメーカーがサンプルのチャネルを変更するようにすることができます。スイムレーンの中心近くの車線を選択して実行します。

サンプルの2つのレーンの端にあるエッジ効果は、このようになります。より遅い電気泳動速度を試すことができます......

接着剤が調製されたときに十分に押されていないか、接着剤が十分に調製されていないか、電気泳動電圧が高すぎるか、電気吸気力が強いか、ガラス板が電気泳動中によく締められていないか、内側の電気泳動溶液が漏れているので、1つずつチェックしてください。

• マーカーバンドの広がりの問題を解決する方法は？

原因1：サンプルの量が多すぎるため、サンプルの量を減らす必要があります。

対策：サンプルの濃度とゲルの厚さに応じて、サンプルの体積を柔軟に制御する必要があります。一般に、サンプル量は10〜15μL（つまり、タンパク質2〜10μg）です。サンプルが非常に希釈している場合、サンプル量は100μLに達することがあります。

原因2：サンプルの不完全溶解。

対策：

（1）サンプルは完全に溶解する必要があります。 あらゆる種類のタンパク質サンプルを保ち、マーカーはサンプリングする前に完全に溶解できます。サンプリング前にサンプルを遠心にし、溶解できない粒子を除去することをお勧めします。

（2）分子量標準のプロテインキットの要件に従って、サンプル溶解ソリューションを追加できます。 標準および未知のサンプルが自己構成されている場合は、0.5-1.0mg/Lのサンプル溶解溶液に従ってください。溶解後、それをEPチューブに移し、キャップを装着し（キャップ​​にクリップを追加できます）、摂氏110度の水浴で3分間加熱します（薄い発泡スチロールプレートのEPチューブと同じ直径のいくつかの丸い穴を掘削できます。 EPチューブ、沸騰したお湯の中で、薄い発泡スチロール板は沸騰したお風呂に自然に浮かびます。

EPチューブのバッチは、沸騰したお湯にさまざまな時間に配置できます。 （EPチューブを沸騰したお湯に投げ込まないでください。ふたを洗い流すことができます）、次に使用するために室温で冷却します。サンプルが長期間使用されていない場合は、サンプルを-20℃の冷蔵庫に保管し、必要に応じてサンプルを摂氏110度の沸騰水で3分間室温で3分間加熱し、使用のために除去し、サンプルを塗布してサンプルタンパク質の実質凝集体を除去します。

（3）サンプルを完全に溶解できるようにサンプルバッファー溶液を変更し、SDSの量が十分である必要があります。

理由：SDSバンドは、隣接タンパク質に電気泳動的にリンクされています。サンプルの過剰サンプリングと不完全な溶解に加えて、ゲルのサンプルウェルの漏れにより、電気泳動帯が広がる可能性があります。漏れは、多くの場合、ジェルとガラス板の間の亀裂によって引き起こされます。対策：現時点では、ゲルは再準備できます。ゲルの結束を引き上げるときは、櫛に注意する必要があります。速度が速すぎることはありません。ゲルの両側にあるガラス板の間の亀裂を避けるために、ゲル調製の過程でジェルの両側のガラス板を絞らないでください。