Visningar: 0 Författare: Webbplatsredaktör Publicera tid: 2023-08-21 Ursprung: Plats
Proteinmarkör definition och användning
Proteinmarkör är en blandning av proteiner med känd molekylvikt, som används som en 'linjal' för att indikera storleken på proteinband.
In the process of Western Blot, the molecular weight marker is like a screw, although it is a small link, however, it is such a small detail that has a significant effect on the experimental results.The role of the marker is mainly used to indicate the molecular weight of the protein bands corresponding to the size of the molecular weight, and only if the standard amount of accurate and correct, the results of the experiments are convincing, in addition to protein Marker also shows whether the Membranet transfekteras eller inte. Dessutom visar det också om membranöverföringen är framgångsrik eller inte, och graden av elektrofores av proteinet på gelén osv. Därför är det att välja rätt proteinmarkör också ett av de nödvändiga förutsättningarna för framgången för Western blot -experiment.
Klassificering av proteinmarkörer
I allmänhet kategoriseras de mest använda proteinmarkörerna i icke-förfärgade proteinmarkörer och förfärgade proteinmarkörer.
Icke-förfärgad proteinmarkör
Det är ett förblandning av flera proteiner med känd molekylvikt och renad, vilket är bekvämt för jämförelse av proteiner i olika storlekar. Icke-förfärgad markör är inte lika bra som förfärgad markör eftersom den är helt osynlig under elektrofores, och kan endast indikeras efter proteinfärgning i slutet av elektrofores, och inte kan användas som referens i den experimentella processen, som tillhör typen av 'eftertänksamhet '. Eftersom proteinet inte åtföljs av en färgämnesmolekyl eller en markörmolekyl är storleken som visas exakt den ursprungliga storleken på proteinet, så det är mer exakt och kan exakt bestämma storleken på proteinet.
Förmixad markör har vanligtvis några band som fördubblar koncentrationen som en indikation, eftersom ju fler band är blandade, desto sämre är det att komma ihåg, vem vet vilken som är den! Det är svårt att räkna tills dina ögon är suddiga. Så när du ser de särskilt koncentrerade som markörbanden kommer att komma ihåg var de är. Kom dock ihåg att de mindre banden vanligtvis inte är lika lätta att se. När det gäller urval är det naturligtvis bäst att välja minst ett av de band som liknar i storlek som ditt målprotein, desto bättre desto bättre.
Förfallen proteinmarkör
Förfärgad proteinmarkör är några renade proteiner blandade genom kovalent koppling med ett färgämne, som kan direkt observeras under elektrofores eller membranöverföring.
Förfärgade proteinmarkörer är praktiska för våra experiment. This protein molecular weight standard can help us monitor electrophoresis and estimate mobility during and after electrophoresis, as well as after membrane transfer - for example, if it is known that the optimal zone of resolution for vertical electrophoresis is about 2/3 of the way through the gel, using a pre-stained Marker it is possible to For example, it is known that the optimal resolution zone of vertical electrophoresis is about 2/3 of the gel, if you Använd en förfärgad markör, du kan förutsäga när målproteinet kommer in i den optimala upplösningszonen och stoppar elektrofores för att få den optimala upplösningseffekten; Du kan också avsluta elektrofores i tid om du observerar en abnormitet i markörens elektrofores; Dessutom kan du observera om proteinet överförs fullständigt till membranet efter överföring av membran i Western blot och du kan märka molekylvikten för proteinet på membranet, varför det lockar många laboratorier att köpa den förfärgade proteinstandarden.
Det är värt att notera att den förfärgade proteinmarkören är kovalent kopplad till färgämnet, så migrationsegenskaperna kan förändras när det är elektroforerade under olika buffertförhållanden, vilket kan leda till vissa avvikelser, så det är inte lämpligt för exakt lokalisering av proteiner - men i de flesta fall, banden på markören kanske inte är identiska till målproteet, och det är att det är det är bara det som är samma samma som målprotein. Men i de flesta fall kanske markörbanden inte är exakt samma som vårt målprotein, och vad vi får är bara en referensstorlek i förhållande till markörindikationen, och i slutändan behöver vi västerländska för att karakterisera det, så om vi inte behöver skilja mellan band i liknande storlekar, är den förfärgade markören fortfarande mycket användbar, och det kan också användas i samband med det obestämda proteinet.
Klassificering av förfallen proteinmarkör
Förfärgad proteinmarkör är uppdelad i: monokrom förfärgad och flerfärgad förfärgad, monokrom förfärgad proteinmarkör kommer vanligtvis att använda några av band för att fördubbla koncentrationen av vissa band för att fördjupa tjockleken på vissa band för att föreslå storleken på deras storlek, så att vi snabbt kan memorera och olika mellan storleken på de enskilda band. Färgproteinmarkörer kännetecknas av olika färger, vilket är ännu mer kännbart. Dessutom, om en färgstark regnbågsmarkör kommer ut i ett tråkigt elektroforesexperiment, kommer stämningen att bli lyckligare just nu!
Utöver ovanstående finns det några andra typer av proteinmarkörer på marknaden: fluorescerande proteinmarkörer, biotinylerade markörer, utvecklade proteinmarkörer osv. ....
Dessutom kategoriseras proteinmarkörer i hög molekylvikt, låg molekylvikt och bred molekylvikt enligt molekylviktsområdet. Markörer med hög molekylvikt används ofta för proteiner med stor molekylvikt, medan små molekylviktsområdesmarkörer ofta används för små proteiner eller till och med vissa peptider. Om du tänker på hela laboratoriet väljer du breda molekylviktsmarkörer med mer enhetlig bandfördelning, så att dina proteiner lätt kan bedömas oavsett vilket intervall de är i.
Några problem med markören
Måste alla markörer vara slut?
Till exempel listar instruktionshandboken 7 band, det är faktiskt normalt att ta ut 6 band, det kan vara så att drifttiden inte räcker, om ditt protein inte är särskilt litet, kan du vänta på att den bromfenolblå fronten ska springa ut ur gelén innan du stänger av elektroforesapparaten, så att du ska kunna ha 7 band. Ibland kommer det att finnas 5 band, men så länge de övre och nedre två band i ditt målprotein kan rinner ut behöver det inte vara 7 band.
Vad ska jag göra om markören förvandlas till ett smiley -ansikte?
Först pressas inte gelén
För det andra kan limets flytande vid kanten av plattan och mitten av limet vara annorlunda, det finns inget sätt att göra detta, med viskositeten och ytspänningen. Om en mängd olika metoder inte kan lösa ovanstående fenomen, personlig rådgivning för att ändra en kanal på provet, välj en körfält nära mitten av badbanan för att springa.
Kanteffekt, i utkanten av provets två körfält kommer att vara så här. Du kan prova långsammare elektroforeshastighet ......
Antingen är limet inte väl pressat när det är beredd, limet är inte väl beredd, eller elektroforesspänningen är för hög, den elektroosmotiska kraften är stark, eller glasplattan är inte väl klämd under elektrofores, och den inre elektroforeslösningen läcker, kontrollera dem en efter en.
Hur löser jag problemet med att bredda markeringsband?
Orsak 1: Provvolymen är för mycket, provvolymen bör minskas.
Motåtgärd: Provvolymen bör styras flexibelt enligt provkoncentrationen och geltjockleken. I allmänhet är provvolymen 10-15 ul (dvs 2-10 μg protein). Om provet är mycket utspädd kan provvolymen nå 100 ul.
Orsak 2: Ofullständig upplösning av provet.
Motåtgärder:
(1) Provet ska lösas fullt ut: behålla alla typer av proteinprover och markör kan lösas helt före provtagningen, det är bättre att centrifugera provet före provtagning och ta bort de partiklar som inte kan lösas.
(2) provupplösningslösning kan tillsättas enligt kraven för proteinkit för molekylviktstandarder; Om standard- och okända prover är självkonfigurerade, följ 0,5-1,0 mg/L provupplösningslösning. After dissolution, transfer it to Ep tube, put the cap on (you can add a clip at the cap) and then heat it in a water bath at 110 degrees Celsius for 3 minutes (you can drill several round holes with the same diameter as the Ep tube in the thin Styrofoam plate, and the Ep tube is put down until the edge of the cap is constrained from going down any further, and then put the thin Styrofoam plate, which is exposing most of the body of the Ep Röret, i det kokande vattenbadet, och den tunna styrofoamplattan flyter naturligt i det kokande vattenbadet
Ett parti EP -rör kan placeras i det kokande vattenbadet under olika tider. (Kasta inte EP -rören i det kokande vattenbadet, locken kan tvättas av) och sedan svalna vid rumstemperatur för användning. Om provet inte används under en längre tid, förvara provet i ett kylskåp vid -20 grader Celsius, och vid behov, värm provet i kokande vatten vid 110 grader Celsius i 3 minuter vid rumstemperatur och kyl det innan det tar bort det för användning och applicerar sedan provet för att ta bort de substbara aggregaten i provproteinerna.
(3) Ändra provbuffertlösningen så att provet kan lösas fullt ut och mängden SDS ska vara tillräcklig.
Orsak: SDS -band är elektroforetiskt kopplade till angränsande proteiner. Förutom överprovtagning och ofullständig upplösning av provet kan läckage av provetsbrunnarna i gelén få de elektroforetiska banden att bredda. Läckaget orsakas ofta av sprickor mellan gelén och glasplattan. Motåtgärder: För närvarande kan gelén endast förberedas på nytt, kammen bör vara försiktig när du drar upp gelkohesionen är klar, hastigheten bör inte vara för snabb, riktningen för att dra upp bör vara vinkelrätt mot gelens yta; För att undvika sprickor mellan glasplattan på båda sidor av gelén och gelén, pressa inte glasplattan på båda sidor av gelén i processen med gelpreparat.
