Zobraziť: 0 Autor: Editor stránok Publikovať Čas: 2023-08-21 Pôvod: Miesto
Definícia a používanie proteínových markerov
Proteínový marker je zmes proteínov známej molekulovej hmotnosti, ktorá sa používa ako 'pravítko ' na označenie veľkosti proteínových pásov.
V procese western blotu je marker molekulovej hmotnosti ako skrutka, hoci je to malý odkaz, je to však taký malý detail, ktorý má významný vplyv na experimentálne výsledky. Úloha markeru sa používa hlavne na označenie molekulárnej hmotnosti proteínových pásov, ktoré sú tiež podľa molekulárnej hmotnosti zodpovedajúce, či sa podľa protelových protestov zodpovedá aj tomu, či sa protestinuje, či už aj pri protestíre sa konvírne vykazuje, či sa protestí membrána je transfekovaná alebo nie. Okrem toho tiež ukazuje, či je prenos membrány úspešný alebo nie, a stupeň elektroforézy proteínu na géli atď. Preto je výber správneho proteínového markera tiež jedným z nevyhnutných podmienok pre úspech experimentov Western blot.
Klasifikácia proteínových markerov
Všeobecne sa najbežnejšie používané proteínové markery rozdeľujú do nefarbených proteínových markerov a predfarbených proteínových markerov.
Proteínový marker bez zafarbenia
Je to premixu niekoľkých proteínov známych molekulovej hmotnosti a purifikovaných, čo je vhodné na porovnanie proteínov rôznych veľkostí. Non-prefarbený marker nie je taký dobrý ako vopred zafarbený marker, pretože je úplne neviditeľný počas elektroforézy a dá sa naznačovať iba po zafarbení proteínov na konci elektroforézy a nemôže sa použiť ako referencia v experimentálnom procese, ktorý patrí k typu „Hindsight “. Pretože však proteín nie je sprevádzaný molekulami farbiva alebo markerovou molekulou, ukázaná veľkosť je presne pôvodná veľkosť proteínu, takže je presnejšia a môže presne určiť veľkosť proteínu.
Vopred zmiešaný marker má zvyčajne niekoľko pásiem, ktoré zdvojnásobujú koncentráciu ako indikáciu, pretože čím viac pásov je zmiešané, tým horšie je pamätať si, kto vie, ktorý z nich je ten! Je ťažké počítať, kým vaše oči nebudú rozmazané. Takže keď uvidíte obzvlášť koncentrované kapely, budú si pamätať, kde sú. Pamätajte však, že menšie kapely zvyčajne nie sú také ľahké. Pokiaľ ide o výber, samozrejme je najlepšie zvoliť si aspoň jeden z pásov, ktoré majú podobnú veľkosť ako cieľový proteín, tým bližšie, tým lepšie.
Pretestový proteínový marker
Predfarbený proteínový marker je niektoré purifikované proteíny zmiešané kovalentným väzbou s farbivom, ktoré je možné priamo pozorovať počas elektroforézy alebo prenosu membrány.
Pre naše experimenty sú vopred zafarbené markery proteínov. Tento štandard molekulovej hmotnosti proteínu nám môže pomôcť monitorovať elektroforézu a odhadnúť mobilitu počas a po elektroforéze, ako aj po prenose membrány-napríklad, ak je známe, že optimálna zóna rozlíšenia pre vertikálnu elektroforézu je asi 2/3 cesty gélu, ak je to možné, ak je to možné, ak je to možné, ak je to možné, ak je to možné, ak je možné, ak je to možné, ak používate vopred zafarbený gél, ak je to možné, ak je možné, ak je to možné, ak je to možné, ak je to možné, ak je to možné, ak je to možné, ak je to možné, je možné, že je možné, že je možné, že je možné, ak je to možné, ak je to možné, je možné, že je možné, že je možné optimálnu zónu rozlíšenia pre vertikálnu elektroforézu, že optimálna zóna optimálnej zóny vertikálneho priečku je približne zafarbená, ak je možné približne zafarbeným gérom, ak je možné približne zafarbené géli Marker, môžete predpovedať, kedy cieľový proteín vstupuje do optimálnej zóny rozlíšenia a zastavuje elektroforézu, aby ste dosiahli optimálny efekt rozlíšenia; Elektroforézu môžete tiež ukončiť v čase, ak pozorujete abnormalitu pri elektroforéze markera; Okrem toho môžete pozorovať, či sa proteín po prenose membrány v Western blot úplne prenesie na membránu, a na membráne môžete označiť molekulovú hmotnosť proteínu, a preto priťahuje veľa laboratórií na kúpu vopred zafarbeného proteínového štandardu.
Je potrebné poznamenať, že vopred zafarbený proteínový marker je kovalentne spojený s farbivom, takže migračné charakteristiky sa môžu meniť, keď sa elektroforézuje za rôznych tlmivých podmienok, čo môže viesť k určitým odchýlkam, takže nie je vhodný pre presnú lokalizáciu proteínov - vo väčšine prípadov, ale vo väčšine prípadov, pásy na markeri nemusia byť rovnaké ako cieľový proteín a výsledky, ktoré dostávame, a to isté, čo je isté, čo je isté, čo je isté, ako sú to isté ako pro protestin. Vo väčšine prípadov však markerové pásy nemusia byť úplne rovnaké ako náš cieľový proteín a to, čo dostaneme, je iba referenčná veľkosť v porovnaní s indikáciou markerov a nakoniec je potrebné, aby sme ho charakterizovali, takže ak nemusíme rozlišovať medzi pásmami podobných veľkostí, vopred zafarbeným markerom je stále veľmi užitočný a môže sa tiež použiť v spojení s štandardom nezastaveného proteínu.
Klasifikácia predpísaného proteínového markera
Predfarbený proteínový marker je rozdelený na: monochrómový predfarbený a viacfarebný predfarbený, monochrómový predfarbený proteínový marker bude zvyčajne používať niektoré z pásov na zdvojnásobenie koncentrácie určitých pásov na prehĺbenie hrúbky určitých pásov, aby naznačil veľkosť ich veľkosti, aby sme si mohli rýchlo zapamätať a rozlišovať medzi veľkosťou jednotlivých pásov. Markery farebných proteínov sa vyznačujú rôznymi farbami, ktoré sú ešte rozpoznateľnejšie. Okrem toho, ak v experimente s matným elektroforézovým experimentom vyjde farebná dúhová marker, nálada bude v tomto okamihu šťastnejšia!
Okrem vyššie uvedeného sú na trhu niektoré ďalšie typy proteínových markerov: fluorescenčné proteínové markery, biotinylované markery, vyvinuté proteínové markery atď.
Okrem toho sa proteínové markery kategorizujú na vysokú molekulovú hmotnosť, nízku molekulovú hmotnosť a širokú molekulovú hmotnosť podľa rozsahu molekulovej hmotnosti. Rozsah vysokej molekulovej hmotnosti sa často používajú pre proteíny s veľkou molekulovou hmotnosťou, zatiaľ čo markery s malými molekulárnymi hmotnosťami sa často používajú pre malé proteíny alebo dokonca pre niektoré peptidy. Ak uvažujete o celom laboratóriu, vyberte široké markery molekulovej hmotnosti s rovnomernejšou distribúciou pásov, aby sa vaše proteíny mohli ľahko posudzovať bez ohľadu na to, v ktorom intervale sú.
Niektoré problémy s značkou
Musia sa vyčerpať všetky značky?
Napríklad v návode na návod na zoznamy 7 pásov, v skutočnosti je normálne, že vychádzajú 6 pásov, je možné, že čas behu nestačí, ak váš proteín nie je príliš malý, môžete počkať, kým bromofenolový modrý predok pred vypnutím elektroforézneho prístroja by ste mali čakať, aby ste mali mať 7 pásiem. Niekedy bude 5 pásov, ale pokiaľ sa dajú vypuknúť horné a dolné dva pásma vášho cieľového proteínu, nemusí to byť 7 pásov.
Čo mám robiť, ak sa značka zmení na smajlíku?
Po prvé, gél nie je stlačený
Po druhé, plynulosť lepidla na okraji dosky a stred lepidla sa môže líšiť, neexistuje spôsob, ako to urobiť, s viskozitou a povrchovým napätím. Ak celý rad metód nedokáže vyriešiť vyššie uvedený fenomén, výrobca osobných rád na zmenu kanála na vzorke, vyberte jazdný pruh blízko stredu plávajúceho pruhu, ktorý chcete spustiť.
Účinok na okraji, na okraji dvoch jazdných pruhov vzorky, bude taký. Môžete vyskúšať pomalšiu rýchlosť elektroforézy ......
Buď lepidlo nie je dobre stlačené, keď je pripravené, lepidlo nie je dobre pripravené, alebo napätie elektroforézy je príliš vysoké, elektroosmotická sila je silná alebo sklenená doska nie je počas elektroforézy dobre zovretá a vnútorné elektroforézové roztoky uniká, skontrolujte ich jeden po jednom.
Ako vyriešiť problém rozšírenia markerových pásiem?
Príčina 1: Objem vzorky je príliš veľký, objem vzorky by sa mal znížiť.
Protiopatrenie: Objem vzorky by sa mal flexibilne kontrolovať podľa koncentrácie vzorky a hrúbky gélu. Všeobecne je objem vzorky 10-15 ul (tj 2-10 μg proteínu). Ak je vzorka veľmi zriedená, objem vzorky môže dosiahnuť 100 ul.
Príčina 2: Neúplné rozpustenie vzorky.
Protiopatrenia:
(1) Vzorka by mala byť úplne rozpustená: Udržujte všetky druhy vzoriek proteínov a markeru pred vzorkovaním sa môže úplne rozpustiť, je lepšie pred odberom vzoriek centrifúziu a odstrániť častice, ktoré sa nedajú rozpustiť.
(2) Roztok rozpúšťania vzorky sa môže pridať podľa požiadaviek proteínových súprav pre normy molekulovej hmotnosti; Ak sú štandardné a neznáme vzorky konfigurované, postupujte podľa roztoku rozpustenia vzorky 0,5-1,0 mg/l. Po rozpustení ju preneste do trubice EP, nasaďte uzáver (môžete pridať sponku na uzáver) a potom ju zahrievať vo vodnom kúpeli pri 110 stupňoch Celzia po dobu 3 minút (môžete vŕtať niekoľko okrúhlych otvorov s rovnakým priemerom ako EP trubica do dosky tenkého styrofoamu, a doštičku EP je položená dole, až kým nie je hrana čiapky. Trubica, vo vriacej vodnej kúpeli a tenká doska polystyroamu pláva prirodzene vo vriacej vodnej kúpeli.
Dávka trubíc EP sa môže umiestniť do vriaceho vodného kúpeľa na rôzne časy. (Nevyhadzujte trubice EP do vriacej vodnej kúpeľa, viečka sa môžu premyť) a potom ochladiť pri izbovej teplote na použitie. Ak sa vzorka nepoužíva dlhšie časové obdobie, uložte vzorku v chladničke pri -20 stupňov Celzia a ak je to potrebné, zohrejte vzorku vo vriacej vode pri 110 stupňoch Celzia počas 3 minút pri teplote miestnosti a pred odstránením ju ochladte a potom použite vzorku na odstránenie agregátov vzorky vo vzorkových proteínoch.
(3) Zmeňte roztok pufra vzorky tak, aby sa vzorka mohla úplne rozpustiť a množstvo SDS by malo postačovať.
Dôvod: SDS pásy sú elektroforeticky spojené so susednými proteínmi. Okrem nadmerného vzorkovania a neúplného rozpustenia vzorky môže únik vzoriek jamiek gélu spôsobiť rozšírenie elektroforetických pásov. Únik je často spôsobený trhlinami medzi gélom a sklenenou doskou. Protiopatrenia: V tomto okamihu je možné gél znovu pripraviť, hrebeň by mal byť opatrný, keď je dokončená gélová súdržnosť, rýchlosť by nemala byť príliš rýchla, smer ťahania by mal byť kolmý na povrch gélu; Aby sa predišlo trhlinám medzi sklenenou doskou na obidvoch stranách gélu a gélom, nevytlačte sklenenú dosku na obidvoch stranách gélu v procese prípravy gélu.
