Definícia a použitie proteínových markerov
Protein Marker je zmes proteínov so známou molekulovou hmotnosťou, ktorá sa používa ako 'pravítko' na označenie veľkosti proteínových pásov.
V procese Western Blot je marker molekulovej hmotnosti ako skrutka, aj keď je to malý odkaz, je to však taký malý detail, ktorý má významný vplyv na výsledky experimentu. Úloha markera sa používa najmä na označenie molekulovej hmotnosti proteínových pásov zodpovedajúcich veľkosti molekulovej hmotnosti a iba ak je štandardné množstvo presné a správne, výsledky experimentov sú tiež presvedčivé, či je okrem proteínu aj marker transfekovaný alebo nie. Okrem toho tiež ukazuje, či je prenos membránou úspešný alebo nie, a stupeň elektroforézy proteínu na géli atď. Preto je výber správneho proteínového markera tiež jednou z nevyhnutných podmienok úspechu experimentov Western Blot.
Klasifikácia proteínových markerov
Vo všeobecnosti sú najbežnejšie používané proteínové markery kategorizované na proteínové markery bez predfarbenia a vopred zafarbené proteínové markery.
Je to premix niekoľkých proteínov so známou molekulovou hmotnosťou a purifikovaný, čo je vhodné na porovnanie proteínov rôznych veľkostí. Nepredfarbený marker nie je taký dobrý ako vopred zafarbený marker, pretože je počas elektroforézy úplne neviditeľný a môže byť indikovaný len po farbení proteínu na konci elektroforézy a nemôže byť použitý ako referencia v experimentálnom procese, ktorý patrí k typu 'spätného náhľadu'. Keďže však proteín nie je sprevádzaný molekulou farbiva ani molekulou markera, zobrazená veľkosť je presne pôvodná veľkosť proteínu, takže je presnejšia a dokáže presne určiť veľkosť proteínu.
Predmiešaný Marker má zvyčajne niekoľko kapiel, ktoré zdvojnásobujú koncentráciu, pretože čím viac kapiel je zmiešaných, tým horšie je zapamätanie, ktovie, ktorá to je! Je ťažké počítať, kým sa vám oči nerozmazávajú. Takže keď uvidíte tie obzvlášť koncentrované, fixky si zapamätajú, kde sa nachádzajú. Pamätajte však, že menšie pásy zvyčajne nie sú tak ľahko viditeľné. Z hľadiska výberu je samozrejme najlepšie zvoliť aspoň jeden z pásikov, ktorý je veľkosťou podobný vášmu cieľovému proteínu, čím bližšie, tým lepšie.
Vopred zafarbený proteínový marker sú niektoré purifikované proteíny zmiešané spolu kovalentnou väzbou s farbivom, ktoré možno priamo pozorovať počas elektroforézy alebo membránového prenosu.
Predfarbené proteínové markery sú vhodné pre naše experimenty. Tento štandard molekulovej hmotnosti proteínu nám môže pomôcť monitorovať elektroforézu a odhadnúť pohyblivosť počas a po elektroforéze, ako aj po membránovom prenose - napríklad ak je známe, že optimálna zóna rozlíšenia pre vertikálnu elektroforézu je približne 2/3 dráhy gélu, pomocou vopred zafarbeného markera je možné napríklad, že je známe, že optimálna zóna rozlíšenia vertikálnej elektroforézy je približne 3 predpovedať gél, ak použijete približne 2 cieľový proteín vstúpi do zóny optimálneho rozlíšenia a zastaví elektroforézu, aby sa dosiahol efekt optimálneho rozlíšenia; môžete tiež včas ukončiť elektroforézu, ak spozorujete abnormalitu v elektroforéze Markera; okrem toho môžete pozorovať, či sa proteín po prenose membrány úplne prenesie na membránu vo Western blote a môžete označiť molekulovú hmotnosť proteínu na membráne, a preto priťahuje veľa laboratórií, aby si kúpili predfarbený proteínový štandard.
Stojí za zmienku, že vopred zafarbený proteínový marker je kovalentne spojený s farbivom, takže migračné charakteristiky sa môžu zmeniť pri elektroforéze v rôznych podmienkach pufra, čo môže viesť k určitým odchýlkam, takže nie je vhodný na presnú lokalizáciu proteínov - vo väčšine prípadov však pásy na markeri nemusia byť identické s cieľovým proteínom a výsledky, ktoré dostaneme, sú rovnaké ako cieľový proteín. Avšak vo väčšine prípadov nemusia byť pásy markerov úplne rovnaké ako náš cieľový proteín a to, čo dostaneme, je len referenčná veľkosť vzhľadom na indikáciu markera a nakoniec potrebujeme Western, aby sme to charakterizovali, takže ak nepotrebujeme rozlišovať medzi pásmi podobných veľkostí, vopred zafarbený marker je stále veľmi užitočný a môže sa použiť aj v spojení so štandardom nezafarbeného proteínu.
Klasifikácia predfarbeného proteínového markera
Predfarbený proteínový marker sa delí na: monochromatický predfarbený a viacfarebný predfarbený, monochromatický predfarbený proteínový marker zvyčajne použije niektoré z pásov na zdvojnásobenie koncentrácie určitých pásov, aby prehĺbil hrúbku určitých pásov, aby naznačil veľkosť ich veľkosti, aby sme si mohli rýchlo zapamätať a rozlíšiť veľkosť jednotlivých pásov. Farebné proteínové markery sú odlíšené rôznymi farbami, čo je ešte viac rozpoznateľné. Navyše, ak v experimente s nudnou elektroforézou vyjde farebný dúhový marker, nálada bude v tomto čase veselšia!
Okrem vyššie uvedených sú na trhu niektoré ďalšie typy proteínových markerov: fluorescenčné proteínové markery, biotinylované markery, vyvinuté proteínové markery atď.
Okrem toho sú proteínové markery rozdelené do kategórií s vysokou molekulovou hmotnosťou, nízkou molekulovou hmotnosťou a širokou molekulovou hmotnosťou podľa rozsahu molekulovej hmotnosti. Markery s vysokou molekulovou hmotnosťou sa často používajú pre proteíny s veľkou molekulovou hmotnosťou, zatiaľ čo markery s nízkou molekulovou hmotnosťou sa často používajú pre malé proteíny alebo dokonca niektoré peptidy. ak vezmete do úvahy celé laboratórium, vyberte si markery so širokou molekulovou hmotnosťou s rovnomernejším rozložením pásov, aby sa vaše proteíny dali ľahko posúdiť bez ohľadu na to, v akom intervale sa nachádzajú.
Niektoré problémy s Markerom
Napríklad návod na použitie uvádza 7 prúžkov, v skutočnosti je normálne vyčerpať 6 prúžkov, môže sa stať, že doba chodu nie je dostatočná, ak váš proteín nie je príliš malý, môžete pred vypnutím elektroforézneho prístroja počkať, kým sa predná časť brómfenolovej modrej minie z gélu, takže by ste mali mať 7 prúžkov. Niekedy tam bude 5 pásov, ale pokiaľ horné a spodné dva pásy vášho cieľového proteínu môžu byť vyčerpané, nemusí to byť 7 pásov.
Po prvé, gél nie je stlačený
Po druhé, tekutosť lepidla na okraji dosky a v strede lepidla môže byť odlišná, neexistuje spôsob, ako to urobiť, s viskozitou a povrchovým napätím. Ak rôzne metódy nedokážu vyriešiť vyššie uvedený jav, osobný poradca, aby zmenil kanál na vzorke, si na spustenie behu vyberte dráhu blízko stredu dráhy plávania.
Efekt okraja, na okraji dvoch pruhov vzorky bude takýto. Môžete skúsiť pomalšiu rýchlosť elektroforézy ......
Buď lepidlo nie je dobre stlačené, keď je pripravené, lepidlo nie je dobre pripravené, alebo je elektroforézne napätie príliš vysoké, elektroosmotická sila je silná, alebo sklenená platňa nie je dobre upnutá počas elektroforézy a vnútorný elektroforézny roztok uniká, skontrolujte ich jeden po druhom.
Príčina 1: Objem vzorky je príliš veľký, objem vzorky by sa mal zmenšiť.
Protiopatrenie: Objem vzorky by sa mal flexibilne regulovať podľa koncentrácie vzorky a hrúbky gélu. Vo všeobecnosti je objem vzorky 10-15μl (tj 2-10μg proteínu). Ak je vzorka veľmi zriedená, objem vzorky môže dosiahnuť 100 μl.
Príčina 2: Neúplné rozpustenie vzorky.
Protiopatrenia:
(1) Vzorka by mala byť úplne rozpustená: uchovávajte všetky druhy proteínových vzoriek a Marker sa môže pred odberom úplne rozpustiť, je lepšie vzorku pred odberom odstrediť a odstrániť častice, ktoré sa nedajú rozpustiť.
(2) Vzorkový roztok na rozpúšťanie sa môže pridať podľa požiadaviek proteínových súprav pre štandardy molekulovej hmotnosti; ak sú štandardné a neznáme vzorky konfigurované samostatne, postupujte podľa 0,5-1,0 mg/l roztoku na rozpustenie vzorky. Po rozpustení preneste do Ep skúmavky, nasaďte uzáver (môžete pridať sponu na uzáver) a potom ho zohrejte vo vodnom kúpeli pri 110 stupňoch Celzia po dobu 3 minút (do tenkej polystyrénovej dosky môžete vyvŕtať niekoľko okrúhlych otvorov s rovnakým priemerom ako Ep rúrka a Ep rúrka sa dá dole, až kým okraj uzáveru nebude obmedzovaný, a potom nebude klesať čo najtenšie. telesa Ep trubice vo vriacom vodnom kúpeli a tenká polystyrénová doska prirodzene pláva vo vriacom vodnom kúpeli Tenká polystyrénová doska prirodzene pláva na povrchu vriacej vody, čo uľahčuje prístup a zahrievanie a zabraňuje striekaniu vriacej vody.
Do vriaceho vodného kúpeľa sa môže na rôzne časy umiestniť dávka Ep skúmaviek. (Nehádžte Ep skúmavky do vriaceho vodného kúpeľa, viečka sa môžu umyť) a potom ich pred použitím ochlaďte na izbovú teplotu. Ak sa vzorka dlhší čas nepoužíva, skladujte vzorku v chladničke pri teplote -20 stupňov Celzia a v prípade potreby vzorku zohrejte vo vriacej vode pri teplote 110 stupňov Celzia na 3 minúty pri izbovej teplote a pred vybratím na použitie ju ochlaďte a potom naneste vzorku na odstránenie substabilných agregátov v proteínoch vzorky.
(3) Zmeňte tlmivý roztok vzorky tak, aby sa vzorka mohla úplne rozpustiť a množstvo SDS by malo byť dostatočné.
Dôvod: Pásy SDS sú elektroforeticky spojené so susednými proteínmi. Okrem nadmerného odberu a neúplného rozpustenia vzorky môže presakovanie z jamiek na vzorky gélu spôsobiť rozšírenie elektroforetických pásov. Únik je často spôsobený prasklinami medzi gélom a sklenenou doskou. Protiopatrenia: Gél je v tomto čase možné iba znovu pripraviť, hrebeň by mal byť opatrný pri vyťahovaní súdržnosti gélu dokončené, rýchlosť by nemala byť príliš vysoká, smer vyťahovania by mal byť kolmý na povrch gélu; Aby ste sa vyhli prasklinám medzi sklenenou platňou na oboch stranách gélu a gélom, nestláčajte sklenenú platňu na oboch stranách gélu počas prípravy gélu.
