نشانگر پروتئین | نحوه انتخاب | تجزیه و تحلیل مسئله

تعریف و استفاده از نشانگر پروتئین

نشانگر پروتئین ترکیبی از پروتئین های وزن مولکولی شناخته شده است که به عنوان 'خط کش' برای نشان دادن اندازه باند پروتئین استفاده می شود.

در فرآیند وسترن بلات ، نشانگر وزن مولکولی مانند یک پیچ است ، اگرچه یک پیوند کوچک است ، با این حال ، چنین جزئیات کوچکی است که تأثیر قابل توجهی در نتایج تجربی دارد. آیا نقش نشانگر به طور عمده برای نشان دادن وزن مولکولی باند پروتئین مربوط به اندازه وزن مولکولی استفاده می شود ، و فقط در صورتی که مقدار استانداردی از تخصص ها باشد. غشای ترانسفکت شده یا نه. علاوه بر این ، همچنین نشان می دهد که آیا انتقال غشای موفقیت آمیز است یا خیر ، و میزان الکتروفورز پروتئین روی ژل و غیره. بنابراین ، انتخاب نشانگر پروتئین مناسب نیز یکی از شرایط لازم برای موفقیت آزمایش های وسترن است.

طبقه بندی نشانگرهای پروتئین

به طور کلی ، متداول ترین نشانگرهای پروتئین در نشانگرهای پروتئین بدون PRE و نشانگرهای پروتئین از قبل رنگ آمیزی طبقه بندی می شوند.

• نشانگر پروتئین بدون رنگ

این پیش نمایش از چندین پروتئین از وزن مولکولی شناخته شده و خالص است که برای مقایسه پروتئین های اندازه های مختلف مناسب است. نشانگر آغشته به غیر PRE به اندازه نشانگر از قبل رنگ آمیزی مناسب نیست زیرا در طول الکتروفورز کاملاً نامرئی است و فقط می تواند پس از رنگ آمیزی پروتئین در انتهای الکتروفورز نشان داده شود ، و نمی تواند به عنوان مرجع در فرآیند آزمایشی ، که متعلق به نوع 'Hindsight ' است استفاده شود. با این حال ، از آنجا که پروتئین با یک مولکول رنگ یا یک مولکول نشانگر همراه نیست ، اندازه نشان داده شده دقیقاً اندازه اصلی پروتئین است ، بنابراین دقیق تر است و می تواند به طور دقیق اندازه پروتئین را تعیین کند.

نشانگر از قبل مخلوط شده معمولاً چند باند دارد که غلظت را به عنوان یک نشانه دو برابر می کند ، زیرا هرچه گروههای بیشتری مخلوط شوند ، به خاطر سپردن آن بدتر است ، چه کسی می داند کدام یک است! حساب کردن تا زمانی که چشمان شما تار نشود ، سخت است. بنابراین ، هنگامی که افراد متمرکز را می بینید ، گروههای نشانگر به یاد خواهند آورد که کجا هستند. به یاد داشته باشید با این وجود ، گروههای کوچکتر معمولاً به راحتی قابل مشاهده نیستند. از نظر انتخاب ، البته بهتر است حداقل یکی از گروههایی را انتخاب کنید که از نظر اندازه با پروتئین هدف شما مشابه باشد ، هرچه نزدیک تر باشد.

• نشانگر پروتئین قابل استفاده

نشانگر پروتئین از قبل رنگ آمیزی برخی از پروتئین های خالص است که با اتصال کووالانسی با رنگ مخلوط می شوند ، که می توان مستقیماً در هنگام الکتروفورز یا انتقال غشای مشاهده کرد.

نشانگرهای پروتئین از قبل رنگ آمیزی برای آزمایش های ما مناسب هستند. This protein molecular weight standard can help us monitor electrophoresis and estimate mobility during and after electrophoresis, as well as after membrane transfer - for example, if it is known that the optimal zone of resolution for vertical electrophoresis is about 2/3 of the way through the gel, using a pre-stained Marker it is possible to For example, it is known that the optimal resolution zone of vertical electrophoresis is about 2/3 of the gel, if you use a pre-stained نشانگر ، می توانید پیش بینی کنید که پروتئین هدف وارد منطقه وضوح مطلوب می شود و الکتروفورز را متوقف می کند تا اثر وضوح مطلوب را بدست آورد. همچنین در صورت مشاهده ناهنجاری در الکتروفورز نشانگر ، می توانید الکتروفورز را به موقع خاتمه دهید. علاوه بر این ، شما می توانید مشاهده کنید که آیا پروتئین پس از انتقال غشای در وسترن بلات به طور کامل به غشای منتقل می شود و می توانید وزن مولکولی پروتئین را روی غشای برچسب گذاری کنید ، به همین دلیل آزمایشگاه های زیادی را برای خرید استاندارد پروتئین از پیش رنگ شده جذب می کند.

شایان ذکر است که نشانگر پروتئین از قبل رنگ آمیزی کووالانسی با رنگ همراه است ، بنابراین ممکن است ویژگی های مهاجرت در شرایط بافر مختلف تغییر کند ، که ممکن است منجر به برخی از انحرافات شود ، بنابراین برای محلی سازی دقیق پروتئین ها مناسب نیست - با این حال ، در بیشتر موارد ، باند های موجود در نشانگر ممکن است به همان اندازه یکسان نباشند که هدف ما با پروتئین هدف قرار نگیرد و نتایج آن را با پروتئین هدف یکسان نمی کنیم و نتایج آن را یکسان نمی کنیم و نتایج آن را به همان اندازه می دانیم. با این حال ، در بیشتر موارد ، گروههای نشانگر ممکن است دقیقاً مشابه پروتئین هدف ما نباشند ، و آنچه ما می گیریم فقط یک اندازه مرجع نسبت به نشانگر نشانگر است و در پایان ، ما به وسترن نیاز داریم تا آن را توصیف کنیم ، بنابراین اگر نیازی به تمایز بین باندها در اندازه های مشابه نداریم ، نشانگر از قبل ایجاد شده هنوز هم بسیار مفید است ، و همچنین می توان از آن استفاده کرد و در ترکیب با پروتئین ناچیز استفاده می شود.

طبقه بندی نشانگر پروتئین قابل استفاده

نشانگر پروتئین از قبل رنگ آمیزی به این بخش تقسیم می شود: نشانگر پروتئین از قبل رنگ آمیزی شده از قبل رنگ آمیزی از قبل رنگ آمیزی و چند رنگ از قبل رنگ آمیزی ، معمولاً از برخی از باندها برای دو برابر شدن غلظت باند های خاص برای تعمیق ضخامت نوارهای خاص استفاده می کند تا اندازه اندازه آنها را نشان دهد ، بنابراین می توانیم به سرعت بین اندازه باند های جداگانه به یاد بیاوریم. نشانگرهای پروتئین رنگی با رنگهای مختلف متمایز می شوند ، که حتی قابل تشخیص تر است. علاوه بر این ، اگر یک نشانگر رنگارنگ رنگارنگ در یک آزمایش الکتروفورز کسل کننده ظاهر شود ، در این زمان روحیه شادتر خواهد بود!

علاوه بر موارد فوق ، انواع دیگری از نشانگرهای پروتئین در بازار نیز وجود دارد: نشانگرهای پروتئین فلورسنت ، نشانگرهای بیوتینیله ، نشانگرهای پروتئین توسعه یافته و غیره ....

علاوه بر این ، نشانگرهای پروتئین به وزن مولکولی بالا ، وزن مولکولی کم و وزن مولکولی گسترده با توجه به محدوده وزن مولکولی طبقه بندی می شوند. نشانگرهای محدوده وزن مولکولی بالا اغلب برای پروتئین های بزرگ با وزن مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند ، در حالی که نشانگرهای محدوده وزن مولکولی کوچک اغلب برای پروتئین های کوچک یا حتی برخی از پپتیدها استفاده می شوند. اگر کل آزمایشگاه را در نظر می گیرید ، نشانگرهای وزن مولکولی گسترده ای را با توزیع باند یکنواخت تر انتخاب کنید ، به طوری که پروتئین های شما بدون توجه به اینکه در کدام بازه قرار دارند ، به راحتی مورد قضاوت قرار می گیرند.

برخی از مشکلات مربوط به نشانگر

• آیا همه نشانگرها باید تمام شوند؟

به عنوان مثال ، کتابچه راهنمای دستورالعمل 7 باند را لیست می کند ، در واقع طبیعی است که 6 باند را تمام کنید ، ممکن است زمان اجرا کافی نباشد ، اگر پروتئین شما خیلی کوچک نباشد ، می توانید قبل از خاموش کردن دستگاه الکتروفورز از ژل خارج از ژل خارج شوید ، تا بتوانید 7 باند داشته باشید. بعضی اوقات 5 باند وجود خواهد داشت ، اما تا زمانی که دو باند فوقانی و پایین پروتئین هدف شما قابل اتمام باشد ، لازم نیست 7 باند باشد.

• اگر نشانگر به چهره لبخند تبدیل شود ، چه کاری باید انجام دهم؟

اول ، ژل فشرده نمی شود

ثانیا ، سیالیت چسب در لبه صفحه و مرکز چسب ممکن است متفاوت باشد ، با ویسکوزیته و تنش سطح ، هیچ راهی برای انجام این کار وجود ندارد. اگر روشهای متنوعی نمی تواند پدیده فوق را حل کند ، سازنده مشاوره شخصی برای تغییر یک کانال روی نمونه ، یک خط را در نزدیکی مرکز خط شنا انتخاب کنید تا یک اجرا اجرا شود.

اثر لبه ، در لبه دو خط نمونه مانند این خواهد بود. می توانید سرعت الکتروفورز آهسته تر را امتحان کنید ......

یا چسب در هنگام تهیه به خوبی تحت فشار قرار نمی گیرد ، چسب به خوبی آماده نشده است ، یا ولتاژ الکتروفورز خیلی زیاد است ، نیروی الکتروموسوتیک قوی است ، یا صفحه شیشه ای در طول الکتروفورز به خوبی چسبانده نشده است ، و محلول الکتروفورز داخلی نشت می کند ، لطفاً آنها را یک به یک بررسی کنید.

• چگونه می توان مشکل گسترش باندهای نشانگر را حل کرد؟

علت 1: حجم نمونه بیش از حد است ، باید حجم نمونه کاهش یابد.

Countermeasure: حجم نمونه باید با توجه به غلظت نمونه و ضخامت ژل قابل انعطاف باشد. به طور کلی ، حجم نمونه 10-15μl (یعنی 2-10μg پروتئین) است. اگر نمونه بسیار رقیق باشد ، حجم نمونه می تواند به 100μl برسد.

علت 2: انحلال ناقص نمونه.

اقدامات متقابل:

(1) نمونه باید به طور کامل حل شود: انواع نمونه های پروتئین را نگه دارید و نشانگر قبل از نمونه برداری کاملاً حل شود ، بهتر است قبل از نمونه برداری نمونه را سانتریفیوژ کنید و ذراتی را که قابل حل نیستند ، از بین ببرید.

(2) محلول انحلال نمونه با توجه به نیازهای کیت پروتئین برای استانداردهای وزن مولکولی می تواند اضافه شود. اگر نمونه های استاندارد و ناشناخته خود را به خود نشان می دهند ، محلول انحلال نمونه 0.5-1.0mg/l را دنبال کنید. بعد از انحلال ، آن را به لوله EP منتقل کنید ، درپوش را قرار دهید (می توانید یک گیره را در کلاه اضافه کنید) و سپس آن را در یک حمام آب در 110 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه گرم کنید (می توانید چند سوراخ گرد را با همان قطر به عنوان لوله EP در یک صفحه استاروفوم نازک حفر کنید ، و لوله EP به پایین قرار می گیرد تا لبه های آنفامان قرار داده شود و آن را قرار دهید و آن را قرار دهید و آن را از بین می برد. لوله EP ، در حمام آب در حال جوش ، و صفحه نازک استروفیوم به طور طبیعی در حمام آب جوش شناور می شود.

دسته ای از لوله های EP را می توان برای زمان های مختلف در حمام آب جوش قرار داد. (لوله های EP را به داخل حمام آب جوش پرتاب نکنید ، ممکن است درب ها شسته شوند) و سپس در دمای اتاق برای استفاده خنک شوند. اگر نمونه برای مدت زمان طولانی تر استفاده نشده است ، نمونه را در یخچال با دمای 20 درجه سانتیگراد ذخیره کنید و در صورت لزوم ، نمونه را در آب جوش در 110 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق گرم کنید و قبل از برداشتن آن برای استفاده و سپس استفاده از نمونه برای از بین بردن مصالح فرعی در پروتئین های نمونه.

(3) محلول بافر نمونه را تغییر دهید تا نمونه به طور کامل حل شود و مقدار SDS کافی باشد.

دلیل: نوارهای SDS از نظر الکتروفوری با پروتئین های همسایه مرتبط هستند. علاوه بر نمونه گیری بیش از حد و انحلال ناقص نمونه ، نشت چاههای نمونه ژل می تواند باعث گسترش باند های الکتروفورز شود. نشت اغلب در اثر ترک بین ژل و صفحه شیشه ای ایجاد می شود. اقدامات متقابل: در این زمان ، ژل فقط می تواند دوباره آماده شود ، در هنگام تکمیل انسجام ژل باید شانه مراقب باشد ، سرعت نباید خیلی سریع باشد ، جهت کشیدن باید عمود بر سطح ژل باشد. برای جلوگیری از ترک بین صفحه شیشه ای در دو طرف ژل و ژل ، در هر دو طرف ژل در فرآیند تهیه ژل ، صفحه شیشه ای را در دو طرف ژل فشار ندهید.