نشانگر پروتئین | نحوه انتخاب | تجزیه و تحلیل مشکل

تعریف و کاربرد نشانگر پروتئین

نشانگر پروتئین مخلوطی از پروتئین هایی با وزن مولکولی شناخته شده است که به عنوان یک خط کش برای نشان دادن اندازه نوارهای پروتئینی استفاده می شود.

در فرآیند وسترن بلات، نشانگر وزن مولکولی مانند یک پیچ است، اگرچه پیوند کوچکی است، اما جزئیات بسیار کوچکی است که تأثیر قابل توجهی بر نتایج تجربی دارد. نقش نشانگر عمدتاً برای نشان دادن وزن مولکولی نوارهای پروتئینی مربوط به اندازه وزن مولکولی استفاده می‌شود، و تنها در صورتی که مقدار استاندارد افزودن آزمایش نشان دهنده دقیق و صحیح بودن غشاء باشد، آیا نتایج نشانگر پروتئینی دقیق و صحیح است یا خیر. ترانسفکت شده است یا خیر علاوه بر این، موفقیت یا عدم موفقیت انتقال غشا و میزان الکتروفورز پروتئین روی ژل و ... را نیز نشان می دهد، بنابراین انتخاب مارکر پروتئین مناسب نیز یکی از شرایط لازم برای موفقیت آزمایش های وسترن بلات است.

طبقه بندی نشانگرهای پروتئینی

به طور کلی، متداول ترین نشانگرهای پروتئینی به دو دسته نشانگرهای پروتئینی غیر رنگ آمیزی شده و نشانگرهای پروتئینی از پیش رنگ آمیزی شده طبقه بندی می شوند.

• نشانگر پروتئین از پیش رنگ آمیزی نشده

این مخلوطی از چندین پروتئین با وزن مولکولی شناخته شده و خالص شده است که برای مقایسه پروتئین های با اندازه های مختلف مناسب است. نشانگر از پیش رنگ‌آمیزی به خوبی نشانگر از پیش رنگ‌آمیزی نیست، زیرا در طول الکتروفورز کاملاً نامرئی است و فقط پس از رنگ‌آمیزی پروتئین در پایان الکتروفورز قابل نشان‌دادن است و نمی‌تواند به عنوان مرجع در فرآیند آزمایشی، که متعلق به نوع 'بینش پسین' است، استفاده شود. با این حال، از آنجایی که پروتئین با مولکول رنگ یا مولکول نشانگر همراه نیست، اندازه نشان داده شده دقیقاً اندازه اصلی پروتئین است، بنابراین دقت بیشتری دارد و می تواند اندازه پروتئین را با دقت تعیین کند.

نشانگر از پیش مخلوط معمولاً دارای چند باند است که غلظت آن را دو برابر می کند، زیرا هر چه باندهای بیشتری مخلوط شوند، به خاطر سپردن بدتر است، چه کسی می داند که کدام یک است! تا زمانی که چشمان شما تار نشود، شمردن آن سخت است. بنابراین هنگامی که آنهایی را که به طور خاص متمرکز شده‌اند می‌بینید، نوارهای نشانگر به یاد می‌آورند که کجا هستند. با این حال، به یاد داشته باشید، نوارهای کوچکتر معمولاً به راحتی قابل مشاهده نیستند. از نظر انتخاب، البته، بهتر است حداقل یکی از باندها را انتخاب کنید که از نظر اندازه مشابه پروتئین مورد نظر شما باشد، هر چه نزدیکتر باشد، بهتر است.

• نشانگر پروتئین از پیش رنگ شده

نشانگر پروتئینی از پیش رنگ آمیزی شده، برخی از پروتئین های خالص شده است که توسط جفت کووالانسی با یک رنگ مخلوط شده اند، که می تواند به طور مستقیم در طول الکتروفورز یا انتقال غشا مشاهده شود.

نشانگرهای پروتئینی از پیش رنگ آمیزی شده برای آزمایشات ما مناسب هستند. این استاندارد وزن مولکولی پروتئین می تواند به ما در نظارت بر الکتروفورز و تخمین تحرک در حین و بعد از الکتروفورز و همچنین پس از انتقال غشاء کمک کند - برای مثال، اگر مشخص است که منطقه تفکیک پذیری بهینه برای الکتروفورز عمودی حدود 2/3 طول ژل است، با استفاده از یک نشانگر از پیش رنگ آمیزی شده می توان به عنوان مثال، مشخص است که منطقه تفکیک بهینه 3 از ژل استفاده می شود. نشانگر از پیش رنگ آمیزی شده، می توانید پیش بینی کنید که پروتئین مورد نظر چه زمانی وارد منطقه تفکیک بهینه می شود و الکتروفورز را متوقف کنید تا اثر وضوح بهینه را به دست آورید. همچنین در صورت مشاهده ناهنجاری در الکتروفورز نشانگر، می توانید الکتروفورز را به موقع خاتمه دهید. علاوه بر این، می توانید مشاهده کنید که آیا پروتئین پس از انتقال غشا در وسترن بلات به طور کامل به غشاء منتقل می شود یا خیر و می توانید وزن مولکولی پروتئین را روی غشا برچسب گذاری کنید، به همین دلیل است که آزمایشگاه های زیادی را برای خرید استاندارد پروتئین از پیش رنگ آمیزی شده جذب می کند.

شایان ذکر است که نشانگر پروتئین از پیش رنگ‌آمیزی شده به صورت کووالانسی با رنگ جفت می‌شود، بنابراین ویژگی‌های مهاجرت ممکن است در هنگام الکتروفورز شدن در شرایط بافر مختلف تغییر کند، که ممکن است منجر به برخی انحرافات شود، بنابراین برای محلی‌سازی دقیق پروتئین‌ها مناسب نیست - با این حال، در بیشتر موارد، نوارهای روی نشانگر ممکن است با پروتئین هدف یکسان نباشند، و نتایجی که ما به دست می‌آوریم همان پروتئین هدف است. با این حال، در بیشتر موارد، باندهای نشانگر ممکن است دقیقاً مشابه پروتئین هدف ما نباشند، و آنچه به دست می‌آوریم فقط یک اندازه مرجع نسبت به نشانگر نشانگر است، و در پایان، برای مشخص کردن آن به Western نیاز داریم، بنابراین اگر نیازی به تمایز بین نوارهایی با اندازه‌های مشابه نداشته باشیم، نشانگر از قبل رنگ‌آمیزی شده همچنان بسیار مفید است و همچنین می‌توان از آن در ترکیب با پروتئین استاندارد استفاده کرد.

طبقه بندی نشانگر پروتئین از پیش رنگ شده

نشانگر پروتئینی از پیش رنگ آمیزی شده به دو دسته تقسیم می شود: نشانگر از پیش رنگ آمیزی شده تک رنگ و از پیش رنگ آمیزی شده چند رنگ، نشانگر پروتئین پیش رنگ آمیزی تک رنگ معمولاً از برخی باندها برای دو برابر کردن غلظت باندهای خاص استفاده می کند تا ضخامت باندهای خاص را برای نشان دادن اندازه اندازه آنها بیشتر کند تا بتوانیم به سرعت نوارهای جداگانه را به خاطر بسپاریم و بین اندازه آنها تفاوت قائل شویم. نشانگرهای پروتئین رنگی با رنگ های مختلف متمایز می شوند که حتی بیشتر قابل تشخیص است. علاوه بر این، اگر یک نشانگر رنگین کمان در یک آزمایش الکتروفورز کسل کننده بیرون بیاید، در این زمان حال و هوای شادتر خواهد بود!

علاوه بر موارد فوق، انواع دیگری از نشانگرهای پروتئینی در بازار وجود دارد: نشانگرهای پروتئین فلورسنت، نشانگرهای بیوتینیله، نشانگرهای پروتئین توسعه یافته و غیره.

علاوه بر این، نشانگرهای پروتئینی با توجه به محدوده وزن مولکولی به وزن مولکولی بالا، وزن مولکولی کم و وزن مولکولی گسترده طبقه بندی می شوند. نشانگرهای محدوده وزن مولکولی بالا اغلب برای پروتئین‌های با وزن مولکولی بزرگ استفاده می‌شوند، در حالی که نشانگرهای محدوده وزن مولکولی کوچک اغلب برای پروتئین‌های کوچک یا حتی برخی پپتیدها استفاده می‌شوند. اگر کل آزمایشگاه را در نظر می گیرید، نشانگرهایی با وزن مولکولی وسیع با توزیع نواری یکنواخت تر انتخاب کنید تا پروتئین های شما بدون توجه به بازه زمانی که هستند به راحتی قضاوت شوند.

برخی از مشکلات با نشانگر

• آیا همه نشانگرها باید تمام شوند؟

مثلاً در دفترچه راهنما 7 باند ذکر شده است، در واقع طبیعی است که 6 باند تمام شود، ممکن است زمان اجرا کافی نباشد، اگر پروتئین شما خیلی کم نیست، می توانید قبل از خاموش کردن دستگاه الکتروفورز منتظر بمانید تا جلوی ژل آبی بروموفنول تمام شود تا بتوانید 7 باند داشته باشید. گاهی اوقات 5 باند وجود دارد، اما تا زمانی که دو باند بالایی و پایینی پروتئین مورد نظر شما تمام شود، لزومی ندارد که 7 باند باشد.

• اگر نشانگر تبدیل به صورتک شد چه کار باید بکنم؟

ابتدا ژل فشرده نمی شود

ثانیا، سیالیت چسب در لبه صفحه و مرکز چسب ممکن است متفاوت باشد، با ویسکوزیته و کشش سطحی، راهی برای انجام این کار وجود ندارد. اگر با روش‌های مختلف نمی‌توان پدیده فوق را حل کرد، مشاور شخصی برای تغییر یک کانال در نمونه، یک خط نزدیک به مرکز خط شنا را برای اجرای دو انتخاب کنید.

جلوه لبه، در لبه دو خط نمونه به این صورت خواهد بود. می توانید سرعت الکتروفورز کندتر را امتحان کنید ......

یا هنگام تهیه چسب خوب فشرده نشده است، چسب به خوبی آماده نشده است، یا ولتاژ الکتروفورز خیلی زیاد است، نیروی الکترواسموتیک قوی است، یا صفحه شیشه ای در حین الکتروفورز به خوبی گیر نکرده است و محلول الکتروفورز داخلی نشتی دارد، لطفا یکی یکی آنها را بررسی کنید.

• چگونه مشکل گسترش باندهای نشانگر را حل کنیم؟

علت 1: حجم نمونه خیلی زیاد است، حجم نمونه باید کاهش یابد.

اقدام متقابل: حجم نمونه باید به طور انعطاف پذیر با توجه به غلظت نمونه و ضخامت ژل کنترل شود. به طور کلی، حجم نمونه 10-15μL (یعنی 2-10μg پروتئین) است. اگر نمونه بسیار رقیق باشد، حجم نمونه می تواند به 100μL برسد.

علت 2: انحلال ناقص نمونه.

اقدامات متقابل:

(1) نمونه باید به طور کامل حل شود: انواع نمونه های پروتئین را نگه دارید و نشانگر را می توان قبل از نمونه گیری به طور کامل حل کرد، بهتر است نمونه را قبل از نمونه برداری سانتریفیوژ کنید و ذراتی را که قابل حل نیستند حذف کنید.

(2) محلول انحلال نمونه را می توان با توجه به الزامات کیت های پروتئین برای استانداردهای وزن مولکولی اضافه کرد. اگر نمونه های استاندارد و ناشناخته خود پیکربندی شده اند، از محلول انحلال نمونه 0.5-1.0mg/L پیروی کنید. پس از حل شدن، آن را به لوله Ep منتقل کنید، درپوش را بگذارید (می توانید یک گیره در درپوش اضافه کنید) و سپس آن را در حمام آب با دمای 110 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه گرم کنید (می توانید چندین سوراخ گرد به همان قطر لوله Ep در صفحه نازک پلی استایرن ایجاد کنید، و لوله Ep را از قسمت پایین قرار می دهیم و سپس درپوش را پایین می گذاریم تا به حالت estra برود. صفحه نازک استایروفوم که بیشتر بدنه لوله Ep را در حمام آب جوش قرار می دهد و صفحه نازک پلی استایرن به طور طبیعی در حمام آب در حال جوش شناور می شود.

دسته ای از لوله های Ep را می توان برای زمان های مختلف در حمام آب جوش قرار داد. (لوله های Ep را داخل حمام آب در حال جوش نریزید، ممکن است درب ها شسته شوند) و سپس برای استفاده در دمای اتاق خنک شوند. در صورت عدم استفاده از نمونه برای مدت زمان طولانی، نمونه را در یخچال با دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کنید و در صورت نیاز، نمونه را در آب جوش با دمای 110 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق گرم کنید و قبل از برداشتن برای استفاده سرد کنید و سپس نمونه را برای حذف دانه های ناپایدار در پروتئین های نمونه قرار دهید.

(3) محلول بافر نمونه را طوری تغییر دهید که نمونه به طور کامل حل شود و مقدار SDS کافی باشد.

دلیل: نوارهای SDS به صورت الکتروفورزی به پروتئین های همسایه متصل می شوند. علاوه بر نمونه برداری بیش از حد و انحلال ناقص نمونه، نشت چاه های نمونه ژل می تواند باعث گشاد شدن نوارهای الکتروفورتیک شود. این نشتی اغلب به دلیل ترک های بین ژل و صفحه شیشه ای ایجاد می شود. اقدامات متقابل: در این زمان، ژل را فقط می توان دوباره آماده کرد، شانه باید مراقب باشد که انسجام ژل کامل شود، سرعت نباید خیلی سریع باشد، جهت بالا کشیدن باید عمود بر سطح ژل باشد. برای جلوگیری از ایجاد ترک بین صفحه شیشه ای دو طرف ژل و ژل، در فرآیند تهیه ژل، صفحه شیشه ای را در دو طرف ژل فشار ندهید.