Définition et utilisation des marqueurs protéiques
Le marqueur protéique est un mélange de protéines de poids moléculaire connu, utilisé comme « règle » pour indiquer la taille des bandes protéiques.
Dans le processus de Western Blot, le marqueur de poids moléculaire est comme une vis, bien qu'il s'agisse d'un petit maillon, cependant, c'est un si petit détail qui a un effet significatif sur les résultats expérimentaux. Le rôle du marqueur est principalement utilisé pour indiquer le poids moléculaire des bandes protéiques correspondant à la taille du poids moléculaire, et seulement si la quantité standard est précise et correcte, les résultats des expériences sont convaincants, en plus du marqueur protéique montre également si la membrane est transfectée ou non. De plus, il montre également si le transfert membranaire est réussi ou non, et le degré d'électrophorèse de la protéine sur le gel, etc. Par conséquent, choisir le bon marqueur protéique est également l'une des conditions nécessaires au succès des expériences de Western Blot.
Classification des marqueurs protéiques
En général, les marqueurs protéiques les plus couramment utilisés sont classés en marqueurs protéiques non pré-colorés et marqueurs protéiques pré-colorés.
Il s’agit d’un prémélange de plusieurs protéines de poids moléculaire connu et purifiées, ce qui convient à la comparaison de protéines de tailles différentes. Le marqueur non pré-coloré n'est pas aussi bon que le marqueur pré-coloré car il est complètement invisible pendant l'électrophorèse, et ne peut être indiqué qu'après coloration des protéines à la fin de l'électrophorèse, et ne peut pas être utilisé comme référence dans le processus expérimental, qui appartient au type « rétrospectif ». Cependant, comme la protéine n'est pas accompagnée d'une molécule colorante ou d'une molécule marqueur, la taille indiquée correspond exactement à la taille originale de la protéine, elle est donc plus précise et peut déterminer avec précision la taille de la protéine.
Marker pré-mixé a généralement quelques bandes doublant la concentration à titre indicatif, car plus on mélange de bandes, pire c'est à retenir, qui sait laquelle est celle-là ! Il est difficile de compter jusqu'à ce que vos yeux soient flous. Ainsi, lorsque vous verrez les plus concentrés, les bandes de marquage se souviendront de leur emplacement. N'oubliez pas cependant que les petites bandes ne sont généralement pas aussi faciles à voir. En termes de sélection, bien sûr, il est préférable de choisir au moins une des bandes dont la taille est similaire à celle de votre protéine cible, la plus proche sera le mieux.
Le marqueur protéique pré-coloré est constitué de protéines purifiées mélangées par couplage covalent avec un colorant, qui peuvent être directement observées lors de l'électrophorèse ou du transfert membranaire.
Les marqueurs protéiques pré-colorés conviennent à nos expériences. Cet étalon de poids moléculaire des protéines peut nous aider à surveiller l'électrophorèse et à estimer la mobilité pendant et après l'électrophorèse, ainsi qu'après le transfert de membrane - par exemple, si l'on sait que la zone de résolution optimale pour l'électrophorèse verticale est d'environ 2/3 de la longueur du gel, en utilisant un marqueur pré-coloré, il est possible de. zone de résolution optimale et arrêter l'électrophorèse afin d'obtenir l'effet de résolution optimale ; vous pouvez également terminer l'électrophorèse à temps si vous observez une anomalie dans l'électrophorèse du Marker ; De plus, vous pouvez observer si la protéine est complètement transférée à la membrane après le transfert de la membrane dans le Western Blot et vous pouvez étiqueter le poids moléculaire de la protéine sur la membrane, c'est pourquoi cela incite de nombreux laboratoires à acheter l'étalon de protéine pré-coloré.
Il convient de noter que le marqueur protéique pré-coloré est couplé de manière covalente au colorant, de sorte que les caractéristiques de migration peuvent changer lors de l'électrophorèse dans différentes conditions de tampon, ce qui peut entraîner certains écarts. Il ne convient donc pas à la localisation précise des protéines. Cependant, dans la plupart des cas, les bandes sur le marqueur peuvent ne pas être identiques à la protéine cible et les résultats que nous obtenons sont exactement les mêmes que la protéine cible. Cependant, dans la plupart des cas, les bandes du marqueur peuvent ne pas être exactement les mêmes que notre protéine cible, et ce que nous obtenons est juste une taille de référence par rapport à l'indication du marqueur, et en fin de compte, nous avons besoin de Western pour la caractériser, donc si nous n'avons pas besoin de faire la distinction entre des bandes de tailles similaires, le marqueur pré-coloré est toujours très utile, et il peut également être utilisé en conjonction avec l'étalon de protéine non coloré.
Classification du marqueur protéique précoloré
Le marqueur de protéine pré-coloré est divisé en : le marqueur de protéine pré-coloré monochrome et multicolore pré-coloré, le marqueur de protéine pré-coloré monochrome utilisera généralement certaines des bandes pour doubler la concentration de certaines bandes afin d'approfondir l'épaisseur de certaines bandes pour suggérer la taille de leur taille, afin que nous puissions rapidement mémoriser et différencier la taille des bandes individuelles. Les marqueurs de protéines colorées se distinguent par différentes couleurs, ce qui les rend encore plus reconnaissables. De plus, si un marqueur arc-en-ciel coloré apparaît lors d'une expérience d'électrophorèse ennuyeuse, l'ambiance sera plus heureuse à ce moment-là !
En plus de ce qui précède, il existe d'autres types de marqueurs protéiques sur le marché : marqueurs protéiques fluorescents, marqueurs biotinylés, marqueurs protéiques développés, etc...
De plus, les marqueurs protéiques sont classés en poids moléculaire élevé, faible poids moléculaire et poids moléculaire large en fonction de la plage de poids moléculaire. Les marqueurs à poids moléculaire élevé sont souvent utilisés pour les protéines à poids moléculaire élevé, tandis que les marqueurs à poids moléculaire faible sont souvent utilisés pour les petites protéines ou même certains peptides. si vous considérez l'ensemble du laboratoire, choisissez des marqueurs de poids moléculaire large avec une distribution de bandes plus uniforme, afin que vos protéines puissent être facilement jugées, quel que soit l'intervalle dans lequel elles se trouvent.
Quelques problèmes avec Marker
Par exemple, le manuel d'instructions liste 7 bandes, en fait, il est normal d'en manquer 6, il se peut que le temps de fonctionnement ne soit pas suffisant, si votre protéine n'est pas très petite, vous pouvez attendre que le front bleu de bromophénol soit épuisé du gel avant d'éteindre l'appareil d'électrophorèse, pour que vous puissiez avoir 7 bandes. Parfois, il y aura 5 bandes, mais tant que les deux bandes supérieure et inférieure de votre protéine cible peuvent être épuisées, il n'est pas nécessaire qu'il y ait 7 bandes.
Premièrement, le gel n'est pas pressé
Deuxièmement, la fluidité de la colle au bord de la plaque et au centre de la colle peut être différente, il n'y a aucun moyen de le faire, avec la viscosité et la tension superficielle. Si diverses méthodes ne peuvent pas résoudre le phénomène ci-dessus, conseillez personnellement au fabricant de changer de canal sur l'échantillon, choisissez un couloir proche du centre du couloir de nage pour exécuter une course.
L'effet de bord, au bord des deux voies de l'échantillon, sera comme ceci. Vous pouvez essayer une vitesse d'électrophorèse plus lente ......
Soit la colle n'est pas bien pressée lors de sa préparation, soit la colle n'est pas bien préparée, soit la tension d'électrophorèse est trop élevée, la force électroosmotique est forte, soit la plaque de verre n'est pas bien serrée pendant l'électrophorèse et la solution d'électrophorèse interne fuit, veuillez les vérifier un par un.
Cause 1 : Le volume de l'échantillon est trop important, le volume de l'échantillon doit être réduit.
Contre-mesure : Le volume de l'échantillon doit être contrôlé de manière flexible en fonction de la concentration de l'échantillon et de l'épaisseur du gel. Généralement, le volume de l'échantillon est de 10 à 15 μL (soit 2 à 10 μg de protéines). Si l'échantillon est très dilué, le volume de l'échantillon peut atteindre 100 μL.
Cause 2 : Dissolution incomplète de l'échantillon.
Contre-mesures :
(1) L'échantillon doit être entièrement dissous : conservez toutes sortes d'échantillons de protéines et le marqueur peut être entièrement dissous avant l'échantillonnage, il est préférable de centrifuger l'échantillon avant l'échantillonnage et d'éliminer les particules qui ne peuvent pas être dissoutes.
(2) Une solution de dissolution d'échantillon peut être ajoutée selon les exigences des kits de protéines pour les normes de poids moléculaire ; si les échantillons standard et inconnus sont auto-configurés, suivez une solution de dissolution d'échantillon de 0,5 à 1,0 mg/L. Après dissolution, transférez-le dans le tube Ep, mettez le capuchon (vous pouvez ajouter un clip sur le capuchon), puis chauffez-le dans un bain-marie à 110 degrés Celsius pendant 3 minutes (vous pouvez percer plusieurs trous ronds du même diamètre que le tube Ep dans la fine plaque de polystyrène, et le tube Ep est posé jusqu'à ce que le bord du capuchon soit empêché de descendre plus loin, puis placez la fine plaque de polystyrène, qui expose la majeure partie du corps du tube Ep, dans le bain d'eau bouillante, et la fine plaque de polystyrène flotte naturellement dans le bain d'eau bouillante. La fine feuille de polystyrène flotte naturellement à la surface de l'eau bouillante, ce qui facilite l'accès et la chaleur, et évite les éclaboussures d'eau bouillante.
Un lot de tubes Ep peut être placé dans le bain-marie bouillant pendant des temps différents. (Ne jetez pas les tubes Ep dans le bain-marie bouillant, les couvercles peuvent être lavés) puis laissez-les refroidir à température ambiante pour utilisation. Si l'échantillon n'est pas utilisé pendant une période plus longue, conservez-le au réfrigérateur à -20 degrés Celsius et, si nécessaire, chauffez l'échantillon dans de l'eau bouillante à 110 degrés Celsius pendant 3 minutes à température ambiante et refroidissez-le avant de le retirer pour utilisation, puis appliquez l'échantillon pour éliminer les agrégats substables dans les protéines de l'échantillon.
(3) Changez la solution tampon de l'échantillon afin que l'échantillon puisse être complètement dissous et que la quantité de SDS soit suffisante.
Raison : les bandes SDS sont liées par électrophorèse aux protéines voisines. En plus du suréchantillonnage et de la dissolution incomplète de l'échantillon, une fuite des puits d'échantillon du gel peut provoquer un élargissement des bandes électrophorétiques. La fuite est souvent provoquée par des fissures entre le gel et la plaque de verre. Contre-mesures : à ce stade, le gel ne peut être que re-préparé, le peigne doit être prudent lorsque la cohésion du gel est terminée, la vitesse ne doit pas être trop rapide, la direction de traction doit être perpendiculaire à la surface du gel ; pour éviter les fissures entre la plaque de verre des deux côtés du gel et le gel, ne pressez pas la plaque de verre des deux côtés du gel pendant le processus de préparation du gel.
