Définition et utilisation du marqueur des protéines
Le marqueur protéique est un mélange de protéines de poids moléculaire connu, qui est utilisé comme une 'règle ' pour indiquer la taille des bandes protéiques.
Dans le processus de Western blot, le marqueur de poids moléculaire est comme une vis, bien qu'il s'agisse d'une petite liaison, cependant, c'est un si petit détail qui a un effet significatif sur les résultats expérimentaux. La membrane est transfectée ou non. De plus, il montre également si le transfert de la membrane est réussi ou non, et le degré d'électrophorèse de la protéine sur le gel, etc. Par conséquent, le choix du bon marqueur de protéines est également l'une des conditions nécessaires au succès des expériences Western blot.
Classification des marqueurs protéiques
En général, les marqueurs de protéines les plus couramment utilisés sont classés en marqueurs de protéines non colorés et en marqueurs de protéines pré-colorés.
Il s'agit d'un préliminaire de plusieurs protéines de poids moléculaire connu et purifié, ce qui est pratique pour la comparaison des protéines de différentes tailles. Le marqueur non coloré n'est pas aussi bon que le marqueur pré-coloré car il est complètement invisible pendant l'électrophorèse, et ne peut être indiqué qu'après la coloration des protéines à la fin de l'électrophorèse, et ne peut être utilisée comme référence dans le processus expérimental, qui appartient au type de 'recul '. Cependant, comme la protéine n'est pas accompagnée d'une molécule de colorant ou d'une molécule de marqueur, la taille représentée est exactement la taille d'origine de la protéine, il est donc plus précis et peut déterminer avec précision la taille de la protéine.
Le marqueur pré-mélangé a généralement quelques bandes doublant la concentration en tant qu'indication, car plus les bandes sont mitigées, plus elle est pire pour se souvenir, qui sait lequel est celui-là! Il est difficile de compter jusqu'à ce que vos yeux soient floues. Ainsi, lorsque vous voyez ceux particulièrement concentrés, les bandes de marqueurs se souviendront où elles se trouvent. N'oubliez pas cependant que les petites bandes ne sont généralement pas aussi faciles à voir. En termes de sélection, bien sûr, il est préférable de choisir au moins l'une des bandes de taille similaire à votre protéine cible, plus le mieux est proche.
Le marqueur des protéines pré-colorés est quelques protéines purifiées mélangées par couplage covalente avec un colorant, qui peut être directement observé lors de l'électrophorèse ou du transfert de membrane.
Les marqueurs de protéines pré-colorés sont pratiques pour nos expériences. Cette norme de poids moléculaire des protéines peut nous aider à surveiller l'électrophorèse et à estimer la mobilité pendant et après électrophorèse, ainsi qu'après le transfert de la membrane - par exemple, s'il est connu que la zone optimale de résolution pour l'électrophorèse verticale est d'environ 2/3 de la voie à travers le gel, en utilisant un marqueur pré-coloré. marqueur pré-coloré, vous pouvez prédire lorsque la protéine cible entre dans la zone de résolution optimale et arrêter l'électrophorèse afin d'obtenir l'effet de résolution optimal; Vous pouvez également terminer l'électrophorèse dans le temps si vous observez une anomalie dans l'électrophorèse du marqueur; De plus, vous pouvez observer si la protéine est complètement transférée à la membrane après le transfert de la membrane dans le Western blot et vous pouvez étiqueter le poids moléculaire de la protéine sur la membrane, c'est pourquoi il attire beaucoup de laboratoires pour acheter la norme de protéine pré-colorée.
Il convient de noter que le marqueur de protéines pré-coloré est couplé de manière covalente avec le colorant, de sorte que les caractéristiques de migration peuvent changer lorsqu'ils sont électrophorores dans différentes conditions de tampon, ce qui peut conduire à certains écarts, il ne convient donc pas à la localisation précise des protéines cibles que nous obtenons dans les bandes que la même protéine cible. Cependant, dans la plupart des cas, les bandes de marqueurs peuvent ne pas être exactement les mêmes que notre protéine cible, et ce que nous obtenons n'est qu'une taille de référence par rapport à l'indication de marqueur, et à la fin, nous avons besoin de Western pour le caractériser, donc si nous n'avons pas besoin de distinguer les bandes de tailles similaires, le marqueur pré-contourné est toujours très utile, et il peut également être utilisé en conjonction avec la norme de protéine non formée.
Classification du marqueur de protéines pré-raccroché
Le marqueur de protéines pré-coloré est divisé en: monochrome pré-coloré et multi-couleurs pré-coloré, monochrome, le marqueur de protéines pré-tendues utilisera généralement certaines des bandes pour doubler la concentration de certaines bandes pour approfondir l'épaisseur de certaines bandes pour suggérer la taille de leur taille, afin que nous puissions rapidement mémoriser et différencier entre la taille des bandes individuelles. Les marqueurs de protéines de couleur se distinguent par différentes couleurs, ce qui est encore plus reconnaissable. De plus, si un marqueur arc-en-ciel coloré sort dans une expérience d'électrophorèse terne, l'ambiance sera plus heureuse pour le moment!
En plus de ce qui précède, il existe d'autres types de marqueurs protéiques sur le marché: marqueurs de protéines fluorescents, marqueurs biotinylés, marqueurs de protéines développés, etc.
De plus, les marqueurs de protéines sont classés en poids moléculaire élevé, poids moléculaire faible et poids moléculaire large en fonction de la plage de poids moléculaire. Les marqueurs de la plage de poids moléculaire élevée sont souvent utilisés pour les grandes protéines de poids moléculaire, tandis que les marqueurs de plage de poids moléculaire de petite moléculaire sont souvent utilisés pour les petites protéines ou même certains peptides. Si vous considérez l'ensemble du laboratoire, choisissez de larges marqueurs de poids moléculaire avec une distribution de bande plus uniforme, afin que vos protéines puissent être facilement jugées quel que soit l'intervalle dans lequel ils se trouvent.
Quelques problèmes avec Marker
Par exemple, le manuel d'instructions répertorie 7 bandes, en fait, il est normal de manquer 6 bandes, il se peut que le temps d'exécution ne soit pas suffisant, si votre protéine n'est pas très petite, vous pouvez attendre que le front bleu bromophénol puisse sortir du gel avant de désactiver l'appareil électrophorèse, afin que vous puissiez avoir 7 bandes. Parfois, il y aura 5 bandes, mais tant que les deux bandes supérieures et inférieures de votre protéine cible peuvent être épuisées, il ne faut pas être 7 bandes.
Premièrement, le gel n'est pas pressé
Deuxièmement, la fluidité de la colle au bord de la plaque et le centre de la colle peut être différente, il n'y a aucun moyen de le faire, avec la viscosité et la tension de surface. Si une variété de méthodes ne peut pas résoudre le phénomène ci-dessus, fabricant de conseils personnels pour modifier un canal sur l'échantillon, choisissez une voie près du centre de la voie de natation pour courir.
L'effet du bord, au bord des deux voies de l'échantillon sera comme ça. Vous pouvez essayer la vitesse d'électrophorèse plus lente ......
Soit la colle n'est pas bien pressée lorsqu'elle est préparée, la colle n'est pas bien préparée, soit la tension d'électrophorèse est trop élevée, la force électroosmotique est forte, soit la plaque de verre n'est pas bien serrée pendant l'électrophorèse, et la solution d'électrophorèse intérieure fuit, veuillez les vérifier un par un.
Cause 1: Le volume d'échantillon est trop, le volume de l'échantillon doit être réduit.
Contre-mesure: le volume de l'échantillon doit être contrôlé de manière flexible en fonction de la concentration de l'échantillon et de l'épaisseur du gel. Généralement, le volume de l'échantillon est de 10 à 15 μl (c'est-à-dire 2-10 μg de protéine). Si l'échantillon est très dilué, le volume de l'échantillon peut atteindre 100 μl.
Cause 2: Dissolution incomplète de l'échantillon.
Contre-mesures:
(1) L'échantillon doit être entièrement dissous: garder toutes sortes d'échantillons de protéines et le marqueur peut être complètement dissous avant l'échantillonnage, il est préférable de centrifuger l'échantillon avant l'échantillonnage et d'éliminer les particules qui ne peuvent pas être dissoutes.
(2) une solution de dissolution de l'échantillon peut être ajoutée en fonction des exigences des kits de protéines pour les normes de poids moléculaire; Si les échantillons standard et inconnus sont auto-configurés, suivez une solution de dissolution de l'échantillon de 0,5 à 1,0 mg / L. Après la dissolution, transférez-le dans un tube EP, mettez le capuchon sur (vous pouvez ajouter un clip au capuchon), puis le chauffer dans un bain-marie à 110 degrés Celsius pendant 3 minutes (vous pouvez percer plusieurs trous ronds avec le même diamètre que le tube EP dans la plaque de styrofoam mince, puis le tube EP est placé jusqu'à la plaque de capuchon, puis le fait que le corps est contraint, puis de mettre la plaque de styroam mince, qui est contrainte de la plupart du corps, et ensuite Le tube EP, dans le bain d'eau bouillant, et la fine plaque en polystyrène flotte naturellement dans le bain d'eau bouillante.
Un lot de tubes EP peut être placé dans le bain d'eau bouillante pour différents moments. (Ne jetez pas les tubes EP dans le bain-marie bouillonnant, les couvercles peuvent être lavés) puis refroidir à température ambiante pour une utilisation. Si l'échantillon n'est pas utilisé pendant une période plus longue, conservez l'échantillon dans un réfrigérateur à -20 degrés Celsius, et si nécessaire, chauffez l'échantillon dans de l'eau bouillante à 110 degrés Celsius pendant 3 minutes à température ambiante et refroidissez-le avant de le retirer pour une utilisation, puis appliquant l'échantillon pour éliminer les agrégats complexes dans les protéines de l'échantillon.
(3) Modifier la solution de tampon de l'échantillon afin que l'échantillon puisse être complètement dissous et que la quantité de SDS doit être suffisante.
Raison: les bandes SDS sont liées électrophorétiquement aux protéines voisines. En plus de l'échantillonnage et de la dissolution incomplète de l'échantillon, la fuite des puits d'échantillon du gel peut provoquer l'élargissement des bandes électrophorétiques. La fuite est souvent causée par des fissures entre le gel et la plaque de verre. Contre-mesures: Pour le moment, le gel ne peut être réapporté que, le peigne doit être prudent lorsque le tirage de la cohésion du gel est terminé, la vitesse ne doit pas être trop rapide, la direction de tirage doit être perpendiculaire à la surface du gel; Pour éviter les fissures entre la plaque de verre des deux côtés du gel et du gel, ne pressez pas la plaque de verre des deux côtés du gel en cours de préparation de gel.
