A fehérjemarker meghatározása és használata
A Protein Marker ismert molekulatömegű fehérjék keveréke, amelyet 'vonalzóként' használnak a fehérjesávok méretének jelzésére.
A Western Blot eljárás során a molekulatömeg-marker olyan, mint egy csavar, bár egy kis láncszem, de ez egy olyan apró részlet, amely jelentősen befolyásolja a kísérleti eredményeket. A marker szerepe elsősorban a molekulatömeg méretének megfelelő fehérjesávok molekulatömegének jelzésére szolgál, és csak akkor, ha a standard mennyiségű membrán pontos és helyes, a transzfekciós kísérletek eredményei is igazodnak-e az addíciós vagy a fehérjemembrán Markerhez. nem. Ezen kívül azt is megmutatja, hogy a membrántranszfer sikeres-e vagy sem, illetve a fehérje elektroforézisének mértéke a gélen stb. Ezért a Western Blot kísérletek sikerének egyik szükséges feltétele a megfelelő fehérjemarker kiválasztása is.
A fehérjemarkerek osztályozása
Általánosságban elmondható, hogy a leggyakrabban használt fehérjemarkereket nem előre festett fehérjemarkerekre és előre festett fehérjemarkerekre osztják.
Számos ismert molekulatömegű és tisztított fehérje premixe, amely alkalmas különböző méretű fehérjék összehasonlítására. A nem előfestett Marker nem olyan jó, mint az előfestett Marker, mert teljesen láthatatlan az elektroforézis során, és csak az elektroforézis végén fehérjefestés után jelezhető, és nem használható referenciaként a kísérleti folyamatban, ami az 'utólagos' típusba tartozik. Mivel azonban a fehérjét nem kíséri színezékmolekula vagy markermolekula, a feltüntetett méret pontosan a fehérje eredeti mérete, így pontosabb, és pontosan meg tudja határozni a fehérje méretét.
Az előre kevert Markerben általában van néhány sáv, ami megduplázza a koncentrációt, mert minél több sáv keveredik, annál rosszabb emlékezni, ki tudja, melyik az! Nehéz megszámolni, amíg a szeme homályos. Tehát amikor meglátja a különösen koncentráltakat, a jelölősávok emlékezni fognak, hol vannak. Ne feledje azonban, hogy a kisebb sávokat általában nem olyan könnyű látni. A kiválasztás szempontjából természetesen az a legjobb, ha legalább egy olyan sávot választunk, amely méretében hasonló a célfehérjéhez, minél közelebb van, annál jobb.
Az előfestett fehérjemarker néhány tisztított fehérje, amelyet kovalens kapcsolással kevernek össze egy festékkel, amely közvetlenül megfigyelhető elektroforézis vagy membrántranszfer során.
Az előfestett fehérjemarkerek kényelmesek a kísérleteinkhez. Ez a fehérje molekulatömeg-standard segíthet az elektroforézis monitorozásában és a mobilitás becslésében elektroforézis alatt és után, valamint membrántranszfer után - például, ha ismert, hogy a függőleges elektroforézis optimális felbontási zónája a gélen áthaladó út körülbelül 2/3-a, akkor előre megfestett Marker segítségével lehetséges például, hogy ismert, hogy az elektroforézis optimális felbontású zónája kb. Előfestett Marker, megjósolhatja, hogy a célfehérje mikor lép be az optimális felbontási zónába, és leállíthatja az elektroforézist az optimális felbontási hatás elérése érdekében; az elektroforézist időben is leállíthatja, ha rendellenességet észlel a Marker elektroforézisében; ezen kívül a Western Blot-ban megfigyelhető, hogy a fehérje teljesen átkerül-e a membránba a membrán átvitele után, és a membránon megjelölhető a fehérje molekulatömege, ezért nagyon sok laboratóriumot vonz az előfestett fehérjestandard megvásárlása.
Érdemes megjegyezni, hogy az előfestett fehérje marker kovalensen kapcsolódik a festékhez, így a migrációs jellemzők eltérő pufferkörülmények között elektroforézis hatására megváltozhatnak, ami eltérésekhez vezethet, így nem alkalmas a fehérjék pontos lokalizálására – azonban a legtöbb esetben előfordulhat, hogy a markeren lévő sávok nem azonosak a célfehérjével, és ugyanaz az eredmény, mint a célfehérjével. A legtöbb esetben azonban előfordulhat, hogy a Marker sávok nem teljesen egyeznek meg a célfehérjével, és amit kapunk, az csak egy referencia méret a Marker indikációhoz képest, végül pedig a Western jellemzésére van szükség, így ha nem kell különbséget tenni a hasonló méretű sávok között, akkor az előfestett Marker továbbra is nagyon hasznos, és a festetlen fehérje standarddal együtt is használható.
Az előfestett fehérje marker osztályozása
Az előfestett fehérjemarker a következőkre oszlik: monokróm előfestett és többszínű előfestett, monokróm előfestett fehérjemarker általában a sávok egy részét arra használja, hogy bizonyos sávok koncentrációját megduplázza, hogy bizonyos sávok vastagságát elmélyítse, így a méretük méretére utaljon, így gyorsan meg tudjuk jegyezni és megkülönböztetni az egyes sávok méretét. A színes fehérje markereket különböző színek különböztetik meg, ami még jobban felismerhető. Sőt, ha egy unalmas elektroforézis kísérletben előkerül egy színes szivárványos Marker, ilyenkor vidámabb lesz a hangulat!
A fentieken kívül néhány más típusú fehérjemarker is megtalálható a piacon: fluoreszcens fehérjemarkerek, biotinilált markerek, kifejlesztett fehérjemarkerek stb....
Ezenkívül a fehérjemarkereket molekulatömeg-tartomány szerint nagy molekulatömegű, alacsony molekulatömegű és széles molekulatömegű kategóriába sorolják. A nagy molekulatömeg-tartományú markereket gyakran használják nagy molekulatömegű fehérjékhez, míg a kis molekulatömeg-tartományú markereket gyakran kis fehérjékhez vagy akár egyes peptidekhez. ha az egész laboratóriumot vesszük figyelembe, válasszon széles molekulatömegű markereket, amelyek egyenletesebb sáveloszlással rendelkeznek, így a fehérjék könnyen megítélhetők, függetlenül attól, hogy melyik intervallumban vannak.
Néhány probléma a Markerrel
Például a használati utasítás 7 sávot ír ki, sőt normális, ha 6 sáv elfogy, lehet, hogy nem elég a futási idő, ha nem túl kicsi a fehérje, akkor az elektroforézis készülék kikapcsolása előtt megvárhatod, míg a brómfenolkék front kifogy a gélből, így már 7 sáv is meglesz. Néha 5 sáv lesz, de amíg a célfehérje felső és alsó két sávja elfogy, nem kell 7 sávnak lennie.
Először is, a gélt nem nyomják
Másodszor, a ragasztó folyékonysága a lemez szélén és a ragasztó közepén eltérő lehet, erre nincs mód, a viszkozitás és a felületi feszültség mellett. Ha többféle módszerrel nem lehet megoldani a fenti jelenséget, adjon személyes tanácsot a készítőnek, hogy váltson csatornát a mintán, válasszon egy sávot az úszósáv közepéhez közeli futáshoz.
Éleffektus, a minta két sávjának szélén ilyen lesz. Kipróbálhatod a lassabb elektroforézis sebességet......
Vagy a ragasztó nincs jól összenyomva előkészítéskor, a ragasztó nincs jól előkészítve, vagy túl magas az elektroforézis feszültsége, erős az elektroozmotikus erő, vagy az üveglap nincs jól befogva az elektroforézis során, és a belső elektroforézis oldat szivárog, ezeket egyenként ellenőrizze.
1. ok: A minta térfogata túl sok, a minta térfogatát csökkenteni kell.
Ellenintézkedés: A minta térfogatát rugalmasan kell szabályozni a minta koncentrációjának és a gél vastagságának megfelelően. Általában a minta térfogata 10-15μL (azaz 2-10μg fehérje). Ha a minta nagyon híg, a minta térfogata elérheti a 100 μL-t.
2. ok: A minta nem teljes feloldódása.
Ellenintézkedések:
(1) A mintának teljesen fel kell oldódnia: tartson mindenféle fehérjemintát, és a marker teljesen feloldható a mintavétel előtt, jobb, ha a mintát mintavétel előtt centrifugálja, és távolítsa el a nem oldódó részecskéket.
(2) A mintaoldó oldat hozzáadható a fehérjekészletek molekulatömeg-standardokra vonatkozó követelményei szerint; ha a standard és az ismeretlen minták önkonfiguráltak, kövesse a 0,5-1,0 mg/L mintaoldó oldatot. Feloldódás után helyezzük át az Ep csőbe, tegyük rá a kupakot (a kupakra lehet kapcsot tenni), majd melegítsük 110 Celsius fokos vízfürdőben 3 percig (a vékony hungarocell lemezbe több, az Ep csővel megegyező átmérőjű kerek lyukat is fúrhatunk, és az Ep csövet addig helyezzük le, amíg a kupak széle meg nem szorul, majd lefelé húzódik, Az Ep cső testének nagy részét a forrásban lévő vízfürdőben szabaddá tenni, a vékony hungarocell lemez pedig természetes módon lebeg a forrásban lévő vízfürdőben A vékony hungarocell lap természetesen lebeg a forrásban lévő víz felszínén, így könnyebben hozzáférhet és melegíthető, és elkerülhető a forrásban lévő víz fröccsenése.
Egy adag Ep-csövet különböző időtartamokra helyezhet a forrásban lévő vízfürdőbe. (Ne dobja az Ep csöveket a forrásban lévő vízfürdőbe, a fedők lemoshatók), majd hűtsük le szobahőmérsékletre a használathoz. Ha a mintát hosszabb ideig nem használja, tárolja a mintát hűtőszekrényben -20 Celsius fokon, és szükség esetén melegítse a mintát forrásban lévő, 110 Celsius fokos vízben 3 percig szobahőmérsékleten, majd hűtse le, mielőtt felhasználásra kiveszi, majd a minta felhordása után eltávolítja a mintafehérjékben lévő szubstabil aggregátumokat.
(3) Cserélje ki a mintapufferoldatot, hogy a minta teljesen feloldódjon, és az SDS mennyisége elegendő legyen.
Ok: Az SDS sávok elektroforetikusan kapcsolódnak a szomszédos fehérjékhez. A túlzott mintavételen és a minta tökéletlen feloldódásán kívül a gél mintaüregeinek szivárgása az elektroforetikus sávok kiszélesedését okozhatja. A szivárgást gyakran a gél és az üveglap közötti repedések okozzák. Ellenintézkedések: Ebben az időben a gélt csak újra lehet készíteni, a fésű legyen óvatos a gél felhúzásakor a kohézió befejeződött, a sebesség ne legyen túl gyors, a felhúzás iránya merőleges legyen a gél felületére; A gél és a gél két oldalán lévő üveglap közötti repedések elkerülése érdekében a gélkészítés során ne nyomja össze az üveglapot a gél mindkét oldalán.
