Fehérje marker | Hogyan válasszuk ki | Problémaelemzés

Fehérje marker meghatározása és felhasználása

A protein marker az ismert molekulatömegű fehérjék keveréke, amelyet 'vonalzóként' használnak a fehérjetávok méretének jelzésére.

A Western -blot folyamatában a molekulatömeg -marker olyan, mint egy csavar, bár ez egy kicsi kapcsolat, azonban ez egy olyan kicsi részlet, amely jelentős hatással van a kísérleti eredményekre. A marker szerepét elsősorban a fehérjetávok molekulatömegének jelzésére használják, és csak akkor, ha a memória -jelölőknek a memlementek pontos pontja, az eredmények pontossága, az eredmények, az eredmények, a kísérlet eredményeként, akkor is megmutatják, hogy a kísérlet eredményei az eredményeket megmutatják, hogy a kísérlet eredményeit az eredmények pontossá tegyék, ha a kísérlet eredményeit az eredmények megmutatják, akkor a memória pontosságait is megmutatják, és a memblementumot megmutatják. transzfektált vagy sem. Ezenkívül azt is megmutatja, hogy a membránátvitel sikeres -e vagy sem, és a fehérje elektroforézis mértéke a gélen stb. Ezért a megfelelő fehérje marker kiválasztása szintén az egyik szükséges feltétel a Western blot kísérletek sikeréhez.

A fehérje markerek osztályozása

Általában véve a leggyakrabban használt fehérje markereket nem PRE-vel festett fehérje markerekbe és az előre festett fehérje markerekbe sorolják.

• Nem benyújtott fehérje marker

Ez egy ismert molekulatömegű és tisztított protein premixje, amely kényelmes a különböző méretű fehérjék összehasonlításához. A nem kitöltött marker nem olyan jó, mint az előre festett marker, mivel az elektroforézis során teljesen láthatatlan, és csak az elektroforézis végén lévő fehérjefestés után indítható, és nem használható referenciaként a kísérleti folyamatban, amely a 'utólagos ' típushoz tartozik. Mivel azonban a fehérjét nem kíséri festékmolekula vagy markermolekula, a bemutatott méret pontosan a fehérje eredeti mérete, tehát pontosabb és pontosan meghatározhatja a fehérje méretét.

Az előre összekapcsolt markernek általában néhány sávja van, amely a koncentrációt jelzi, mivel minél több sáv keveredik, annál rosszabb emlékezni kell, ki tudja, melyik az a! Nehéz számolni, amíg a szemed elmosódik. Tehát, amikor meglátja a különösen koncentráltokat, a marker sávok emlékezni fognak, hol vannak. Ne feledje azonban, hogy a kisebb sávok általában nem olyan könnyűek. A szelekció szempontjából természetesen a legjobb, ha legalább az egyik olyan sávot választunk, amely mérete hasonló a célfehérjéhez, minél közelebb van, annál jobb.

• Előzetes protein marker

Az előre festett fehérje marker néhány tisztított fehérjék, amelyek összekeverednek a kovalens kapcsolással egy festékkel, amelyet közvetlenül megfigyelhetnek az elektroforézis vagy a membránátvitel során.

Az előre festett fehérje markerek kényelmesek a kísérleteinkhez. Ez a fehérje molekulatömeg-standard segíthet az elektroforézis monitorozásában és a mobilitás becslése az elektroforézis alatt és után, valamint a membránátvitel után-például ha ismert, hogy a függőleges elektroforézis optimális felbontási zónája a gélen keresztül kb. Marker, megjósolhatja, hogy a célfehérje mikor lép be az optimális felbontási zónába, és leállítja az elektroforézist az optimális felbontási hatás elérése érdekében; Az elektroforézist is időben megszüntetheti, ha a marker elektroforézisében rendellenességet észlel; Ezenkívül megfigyelheti, hogy a fehérje a membrán átadása után a membránba kerül-e a Western-blotban, és a fehérje molekulatömegét a membránon jelölheti, ezért sok laboratóriumot vonz az előre festett fehérje standard megvásárlásához.

Érdemes megjegyezni, hogy az előre festett fehérje marker kovalensen kapcsolódik a festékhez, így a migrációs jellemzők megváltozhatnak, ha különböző puffer körülmények között elektroforézissel bírnak, ami bizonyos eltérésekhez vezethet, tehát nem alkalmas a fehérjék pontos lokalizációjára - azonban a legtöbb esetben a jelölő sávjai nem azonos lehetnek a célfehérjével, és az eredmények csak a célkitűzéssel rendelkeznek. A legtöbb esetben azonban a marker sávok nem pontosan megegyeznek a célfehérjével, és amit kapunk, csak egy referenciaméret a marker-jelzéshez képest, és végül Western-re van szükségünk, tehát ha nem kell megkülönböztetnünk a hasonló méretű sávokat, akkor az előre festett marker még mindig nagyon hasznos, és azt a nem festett protein standarddal együtt is alkalmazhatjuk.

Az előzetes fehérje marker osztályozása

Az előre festett fehérje marker oszlik: a monokróm előre festett és többszínű és több színű előre festett, monokróm előre festett fehérje marker általában a sávok egy részét használja bizonyos sávok koncentrációjának megduplázására, hogy elmélyítsük egyes sávok vastagságát, hogy a méretük méretét javasoljuk, hogy gyorsan megjegyezzük és megkülönböztessük az egyes sávok méretét. A színes fehérje markereket a különböző színek különböztetik meg, ami még jobban felismerhető. Sőt, ha egy színes szivárványos marker jön ki egy tompa elektroforézis kísérletben, akkor a hangulat ebben az időben boldogabb lesz!

A fentiek mellett vannak más típusú fehérje markerek a piacon: fluoreszcens fehérje markerek, biotinilezett markerek, fejlett fehérje markerek stb.

Ezenkívül a fehérje markereket a molekulatömeg -tartomány szerint nagy molekulatömegű, alacsony molekulatömegű és széles molekulatömegű kategóriába sorolják. A nagy molekulatömegű markereket gyakran használják nagy molekulatömegű fehérjékhez, míg a kis molekulatömeg -tartomány markereket gyakran kis fehérjékhez vagy akár néhány peptidhez használják. Ha figyelembe vesszük a teljes laboratóriumot, válasszon széles molekulatömegű markereket, amelyek egységesebb sáv eloszlással rendelkeznek, így a fehérjék könnyen megítélhetők, függetlenül attól, hogy melyik intervallumban vannak.

Néhány probléma a markerrel

• Az összes markert ki kell fogyni?

Például, a használati útmutató 7 sávot sorol fel, valójában normális, ha 6 sávot futtatunk ki, előfordulhat, hogy a futási idő nem elég, ha a fehérje nem túl kicsi, akkor várhatja meg, hogy a brópenol -kék front kifogyjon a gélből, mielőtt kikapcsolná az elektroforézis -készüléket, hogy 7 sáv legyen. Időnként 5 sáv lesz, de mindaddig, amíg a célfehérje felső és alsó része kifogyhat, nem kell, hogy 7 sáv legyen.

• Mit kell tennem, ha a jelölő mosolygó arcává válik?

Először is, a gélt nincs nyomva

Másodszor, a ragasztó folyékonysága a tányér szélén és a ragasztó közepén eltérő lehet, a viszkozitás és a felületi feszültség esetén nincs mód. Ha számos módszer nem tudja megoldani a fenti jelenséget, a személyes tanácskészítőt a mintán lévő csatorna cseréjéhez, válasszon egy sávot az úszási sáv közepén, hogy futtasson.

A szélhatás a minta két sávjának szélén ilyen lesz. Kipróbálhatja a lassabb elektroforézis sebességet ......

Vagy a ragasztót nem nyomja meg jól, amikor elkészítik, a ragasztó nincs jól elkészítve, vagy az elektroforézis feszültsége túl magas, az elektroosmotikus erő erős, vagy az üveglemez nincs jól rögzítve az elektroforézis során, és a belső elektroforézis oldat szivárog, kérjük, ellenőrizze őket egyszerre.

• Hogyan lehet megoldani a marker sávok kibővítésének problémáját?

1. ok: A minta mennyisége túl sok, a minta mennyiségét csökkenteni kell.

Ellenintézés: A minta térfogatát rugalmasan kell szabályozni a minta koncentrációja és a gél vastagsága szerint. Általában a minta térfogata 10-15 μl (azaz 2-10 μg fehérjét). Ha a minta nagyon híg, a minta térfogata elérheti a 100 μl -t.

2. ok: A minta hiányos feloldása.

Ellenintézkedések:

(1) A mintát teljesen fel kell oldani: a mintavétel előtt mindenféle fehérjemintát és marker maradhat, és a mintavétel előtt jobb, ha a mintát a mintavétel előtt centrifugálja, és eltávolíthatja a nem feloldható részecskéket.

(2) A minta feloldódási oldatát hozzá lehet adni a molekulatömeg -standardok fehérjekészleteinek követelményei szerint; Ha a standard és az ismeretlen minták önkonfigurálódnak, kövesse a 0,5-1,0 mg/l minta feloldódási oldatot. A feloldás után helyezze át az EP -csőbe, tegye fel a kupakot (hozzáadhat egy klipet a kupakhoz), majd melegítse meg egy vízfürdőben 110 ° C -on 3 percig (fúrhat több kerek lyukat, amelyek ugyanolyan átmérőjűek, mint az EP cső, a vékony csöves lemezen, és az EP csövet nem teszik le, és ez a test, amelyet a leginkább lefelé kell végezni, és a vékony szédezőt, és az EP -t, és a vékony szédezőt, és az EP -t, és az EP -t, és az EP -t a legszélesebb körben nem zárják le, majd a vékony szédezőt, és az EP csövet nem teszik ki, és a test leginkább a testből áll, és a test leginkább a testből áll, és a test leginkább a testből áll, és a legjobban meg nem áll, és az EP -t a legszélesebb körben elhelyezik. EP -cső, a forrásban lévő vízfürdőben, és a vékony polisztirolemez természetesen lebeg a forrásban lévő vízfürdőben.

Egy tétel EP csöveket lehet helyezni a forrásban lévő vízfürdőbe különböző időpontokban. (Ne dobja az EP csöveket a forrásban lévő vízfürdőbe, a fedeleket le lehet mosni), majd szobahőmérsékleten hűtsük le. Ha a mintát nem használják hosszabb ideig, akkor a mintát hűtőszekrényben tárolja -20 Celsius fokon, és szükség esetén melegítse fel a mintát forrásban lévő vízben 110 fokos Celsius fokon 3 percig szobahőmérsékleten, és hűtse le, mielőtt eltávolítja a mintát, majd a mintát felhordja a mintafehérjékben lévő alátcsökkentő adományanyagok eltávolításához.

(3) Változtassa meg a minta puffer oldatot úgy, hogy a minta teljesen feloldódjon, és az SD -k mennyiségének elegendő legyen.

Ok: Az SDS sávok elektroforetikusan kapcsolódnak a szomszédos fehérjékhez. A minta túlmintavétele és hiányos feloldása mellett a gél minta kutak szivárgása az elektroforetikus sávok kiszélesedését okozhatja. A szivárgást gyakran a gél és az üveglap közötti repedések okozzák. Ellenintézkedések: Ebben az időben a gél csak újra fel kell készülni, a fésűnek óvatosnak kell lennie, ha a gélkohézió felkészülése befejeződik, a sebességnek nem szabad túl gyorsnak lennie, a húzás irányának merőlegesnek kell lennie a gél felületére; Annak elkerülése érdekében, hogy a gél mindkét oldalán lévő üveglemez és a gél mindkét oldalán lévő üveglemez közötti repedések a gél előkészítésének folyamatában ne nyomják meg az üveglemezt a gél mindkét oldalán.