Definição e uso do marcador de proteínas
O marcador de proteínas é uma mistura de proteínas de peso molecular conhecido, que é usado como um 'governante' para indicar o tamanho das bandas de proteínas.
No processo de Western blot, o marcador de peso molecular é como um parafuso, embora seja um pequeno elo, no entanto, é um detalhe tão pequeno que tem um efeito significativo nos resultados experimentais. A membrana é transfectada ou não. Além disso, também mostra se a transferência de membrana é bem -sucedida ou não, e o grau de eletroforese da proteína no gel etc. Portanto, a escolha do marcador de proteína correta também é uma das condições necessárias para o sucesso dos experimentos de Western blot.
Classificação de marcadores de proteínas
Em geral, os marcadores de proteínas mais usados são categorizados em marcadores proteicos não corados e marcadores de proteínas pré-manchadas.
É uma pré -mistura de várias proteínas de peso molecular conhecido e purificado, que é conveniente para a comparação de proteínas de diferentes tamanhos. O marcador não corado não é tão bom quanto o marcador pré-corado, porque é completamente invisível durante a eletroforese e só pode ser indicado após a coloração de proteínas no final da eletroforese e não pode ser usado como referência no processo experimental, que pertence ao tipo de 'retrospectiva'. No entanto, como a proteína não é acompanhada por uma molécula de corante ou uma molécula de marcador, o tamanho mostrado é exatamente o tamanho original da proteína, por isso é mais preciso e pode determinar com precisão o tamanho da proteína.
O marcador pré-misturado geralmente tem algumas bandas dobrando a concentração como uma indicação, porque quanto mais bandas são misturadas, pior é lembrar-se de quem sabe qual é esse! É difícil contar até que seus olhos estejam embaçados. Então, quando você vê os particularmente concentrados, as bandas marcadoras se lembram de onde estão. Lembre -se, porém, as bandas menores geralmente não são tão fáceis de ver. Em termos de seleção, é claro, é melhor escolher pelo menos uma das bandas que seja semelhante em tamanho à sua proteína de destino, para melhor melhor.
O marcador proteico pré-corado é algumas proteínas purificadas misturadas por acoplamento covalente com um corante, que pode ser observado diretamente durante a eletroforese ou transferência de membrana.
Os marcadores de proteínas pré-manchados são convenientes para nossos experimentos. Esse padrão de peso molecular de proteínas pode nos ajudar a monitorar a eletroforese e a mobilidade da estimativa durante e após a eletroforese, bem como após a transferência de membrana - por exemplo, se souber que a zona ideal de resolução para eletroforese vertical é cerca de 2/3 do que o gel, usando um marcador vertical que é possível, por exemplo, é conhecido que é conhecido que é o 2/3 do gel, o uso de um marcador pré -corado é possível, por exemplo, é conhecido que é conhecido que é o 2/3 do Gel, o uso de um marcador vertical é que, por exemplo Marcador pré-corado, você pode prever quando a proteína alvo entra na zona de resolução ideal e interrompe a eletroforese para obter o efeito ideal de resolução; Você também pode encerrar a eletroforese no tempo se observar uma anormalidade na eletroforese do marcador; Além disso, você pode observar se a proteína é transferida completamente para a membrana após a transferência de membrana no Western blot e você pode rotular o peso molecular da proteína na membrana, e é por isso que atrai muitos laboratórios para comprar o padrão de proteína pré-corada.
Vale a pena notar que o marcador de proteínas pré -coradas está covalentemente acoplado ao corante, para que as características da migração possam mudar quando eletroforese em diferentes condições de tampão, o que pode levar a alguns desvios, portanto, não é adequado para a localização precisa das proteínas - no entanto, na maioria dos casos que são os mesmos que o marcador não é idêntico ao alvo da proteína, e, na maioria dos casos, o mesmo que é o marcador, o mesmo que o marcador pode ser identificado para o alvo. No entanto, na maioria dos casos, as bandas de marcadores podem não ser exatamente as mesmas da nossa proteína-alvo, e o que obtemos é apenas um tamanho de referência em relação à indicação de marcador e, no final, precisamos o ocidental para caracterizá-lo; portanto, se não precisarmos distinguir entre bandas de tamanhos semelhantes, o marcador pré-corado ainda é muito útil e também pode ser usado em conjunto com os padrões de proteínas semelhantes.
Classificação do marcador de proteínas protegidas
O marcador de proteínas pré-coradas é dividido em: Monocromo pré-corado e multicolorido pré-corado e monocromático marcador de proteínas manchado geralmente usará algumas das bandas para dobrar a concentração de certas bandas para aprofundar a espessura de certas bandas para sugerir o tamanho de seu tamanho, para que possamos rapidamente memorizar e diferente entre o tamanho do tamanho do tamanho do tamanho do tamanho do indivíduo. Os marcadores de proteínas de cores são distinguidos por cores diferentes, o que é ainda mais reconhecível. Além disso, se um marcador de arco -íris colorido sair em um experimento de eletroforese opaco, o clima ficará mais feliz neste momento!
Além do exposto, existem outros tipos de marcadores de proteínas no mercado: marcadores de proteínas fluorescentes, marcadores biotinilados, marcadores de proteínas desenvolvidos, etc ....
Além disso, os marcadores de proteínas são categorizados em alto peso molecular, baixo peso molecular e peso molecular largo de acordo com a faixa de peso molecular. Os marcadores de alta faixa de peso molecular são frequentemente usados para proteínas de peso molecular grande, enquanto os pequenos marcadores de faixa de peso molecular são frequentemente usados para proteínas pequenas ou até alguns peptídeos. Se você considerar todo o laboratório, escolha marcadores amplos de peso molecular com distribuição de banda mais uniforme, para que suas proteínas possam ser facilmente julgadas, independentemente do intervalo em que estejam.
Alguns problemas com marcador
Por exemplo, o manual de instruções lista 7 bandas, de fato, é normal esgotar 6 bandas, pode ser que o tempo de execução não seja suficiente, se sua proteína não for muito pequena, você pode esperar a frente azul de bromofenol para ficar sem 7 bandas. Às vezes, haverá 5 bandas, mas enquanto as duas bandas superiores e inferiores da sua proteína alvo podem ser acabadas, ela não precisa ser 7 bandas.
Primeiro, o gel não está pressionado
Em segundo lugar, a fluidez da cola na borda da placa e o centro da cola pode ser diferente, não há como fazer isso, com a viscosidade e a tensão superficial. Se uma variedade de métodos não puder resolver o fenômeno acima, conselhos pessoais para trocar um canal na amostra, escolha uma faixa perto do centro da pista de natação para correr.
O efeito de borda, na borda das duas faixas da amostra, será assim. Você pode tentar velocidade de eletroforese mais lenta ......
A cola não é bem pressionada quando está preparada, a cola não está bem preparada ou a tensão da eletroforese é muito alta, a força eletroosmótica é forte ou a placa de vidro não está bem presa durante a eletroforese e a solução de eletroforese interna está vazando, verifique -os por um.
Causa 1: O volume da amostra é demais, o volume da amostra deve ser reduzido.
Contrardeas: O volume da amostra deve ser controlado de maneira flexível de acordo com a concentração da amostra e a espessura do gel. Geralmente, o volume da amostra é de 10-15μl (isto é, 2-10μg de proteína). Se a amostra estiver muito diluída, o volume da amostra poderá atingir 100μl.
Causa 2: dissolução incompleta da amostra.
Contramedidas:
(1) A amostra deve ser totalmente dissolvida: mantenha todos os tipos de amostras de proteínas e o marcador pode ser totalmente dissolvido antes da amostragem, é melhor centrifugar a amostra antes da amostragem e remover as partículas que não podem ser dissolvidas.
(2) a solução de dissolução da amostra pode ser adicionada de acordo com os requisitos de kits de proteínas para padrões de peso molecular; Se as amostras padrão e desconhecidas forem autoconfiguradas, siga a solução de dissolução de amostra de 0,5-1,0 mg/L. Após a dissolução, transfira -o para o tubo EP, coloque a tampa (você pode adicionar um clipe na tampa) e aqueça -o em um banho de água a 110 graus Celsius por 3 minutos (você pode perfurar vários orifícios redondos com o mesmo diâmetro que a borda é mais fina, depois que o tubo de fino, e o tubo é colocado até que a borda é restringida, depois que a borda é a borda é restrita, depois de ser colocada, que a borda da tampa é restrita, e o tubo de borda é mais baixo que a borda é restringida, e a borda é a borda, a borda é mais restrita, e o tubo é colocado até a borda da tampa, na saída, a borda é mais fina, e a borda é mais baixa que a borda é restrita O corpo do tubo EP, no banho de água fervente, e a fina prato de isopor flutua naturalmente no banho de água fervente.
Um lote de tubos de EP pode ser colocado no banho de água fervente por diferentes momentos. (Não jogue os tubos EP no banho de água fervente, as tampas podem ser lavadas) e depois esfrie à temperatura ambiente para uso. Se a amostra não for usada por um período mais longo, armazene a amostra em uma geladeira a -20 graus Celsius e, quando necessário, aqueça a amostra em água fervente a 110 graus Celsius por 3 minutos à temperatura ambiente e resfriá -la antes de removê -la para uso e depois aplicar a amostra para remover os agregados substanciais nas proteínas da amostra.
(3) Altere a solução de buffer de amostra para que a amostra possa ser totalmente dissolvida e a quantidade de SDS deve ser suficiente.
Motivo: as bandas SDS estão eletroforeticamente ligadas às proteínas vizinhas. Além da amostragem excessiva e da dissolução incompleta da amostra, o vazamento dos poços da amostra do gel pode fazer com que as bandas eletroforéticas aumentem. O vazamento é frequentemente causado por rachaduras entre o gel e a placa de vidro. Contrafeases: Nesse momento, o gel só pode ser recusado, o pente deve ter cuidado ao puxar a coesão do gel, a velocidade não deve ser muito rápida, a direção de puxar para cima deve ser perpendicular à superfície do gel; Para evitar rachaduras entre a placa de vidro em ambos os lados do gel e do gel, não esprema a placa de vidro nos dois lados do gel no processo de preparação do gel.
