Görünümler: 0 Yazar: Site Editor Yayınlanma Zamanı: 2023-08-21 Kökeni: Alan
Protein markeri tanımı ve kullanımı
Protein markeri, protein bantlarının boyutunu belirtmek için 'cetvel ' olarak kullanılan bilinen moleküler ağırlıktaki proteinlerin bir karışımıdır.
In the process of Western Blot, the molecular weight marker is like a screw, although it is a small link, however, it is such a small detail that has a significant effect on the experimental results.The role of the marker is mainly used to indicate the molecular weight of the protein bands corresponding to the size of the molecular weight, and only if the standard amount of accurate and correct, the results of the experiments are convincing, in addition to protein Marker also shows whether the Membran transfekte edilir ya da değil. Ek olarak, membran transferinin başarılı olup olmadığını ve proteinin jel üzerindeki elektroforez derecesini de gösterir. Bu nedenle, doğru protein markerini seçmek de Western blot deneylerinin başarısı için gerekli koşullardan biridir.
Protein belirteçlerinin sınıflandırılması
Genel olarak, en sık kullanılan protein markerleri, ön plana çıkmayan protein markörlerine ve önceden boyanmış protein markörlerine kategorize edilir.
Çembersiz protein markeri
Farklı boyutlardaki proteinlerin karşılaştırılması için uygun olan bilinen moleküler ağırlıklı ve saflaştırılmış birkaç proteinin premiksidir. Çembersiz lekelenmemiş marker önceden boyanmış marker kadar iyi değildir, çünkü elektroforez sırasında tamamen görünmezdir ve sadece elektroforezin sonunda protein boyamasından sonra belirtilebilir ve 'arka plan ' tipine ait olan deneysel süreçte bir referans olarak kullanılamaz. Bununla birlikte, proteine bir boya molekülü veya bir marker molekülü eşlik etmediğinden, gösterilen boyut tam olarak proteinin orijinal boyutudur, bu nedenle daha doğrudur ve proteinin boyutunu doğru bir şekilde belirleyebilir.
Önceden karıştırılmış markör genellikle bir gösterge olarak konsantrasyonu ikiye katlayan birkaç bant vardır, çünkü ne kadar fazla bant karışıksa, hatırlamak o kadar kötü, hangisinin bu olduğunu kim bilir! Gözleriniz bulanıklaşana kadar saymak zor. Özellikle konsantre olanları gördüğünüzde işaretleyici bantları nerede olduklarını hatırlayacaktır. Yine de, daha küçük bantların görülmesi o kadar kolay değildir. Seçim açısından, elbette, hedef proteininize benzer boyutta bantlardan en az birini seçmek en iyisidir, o kadar yakın olur.
Prestined protein markeri
Önceden lekelenmiş protein markeri, elektroforez veya membran transferi sırasında doğrudan gözlemlenebilen bir boya ile kovalent bağlanma ile birbirine karıştırılmış bazı saflaştırılmış proteinlerdir.
Önceden lekelenmiş protein belirteçleri deneylerimiz için uygundur. Bu protein moleküler ağırlık standardı, elektroforezi izlememize ve elektroforez sırasında ve sonrasında hareketliliği izlememize yardımcı olabilir ve ayrıca membran transferi sonrası - örneğin, dikey elektroforez için optimal çözünürlük bölgesinin yaklaşık 2/3'ü olduğu biliniyorsa, önceden boyanmış bir belirteç kullanarak, örneğin veritik bir elektroezin optimal çözünürlük bölgesi, mümkündür, 2/, GEL 2/, GEL'nin optimal çözünürlük bölgesinin, 2/, GEL 2/'nin mümkün olduğu bilinmektedir. Önceden lekeli bir marker kullanın, hedef proteinin en uygun çözünürlük bölgesine ne zaman girdiğini tahmin edebilir ve optimum çözünürlük etkisini elde etmek için elektroforezi durdurabilirsiniz; İşaretçinin elektroforezinde bir anormallik gözlemliyorsanız, elektroforezi zamanında sonlandırabilirsiniz; Ek olarak, batı lekesinde membran transferi sonrası proteinin tamamen membrana aktarılıp aktarılacağını gözlemleyebilirsiniz ve proteinin moleküler ağırlığını membran üzerindeki etiketleyebilirsiniz, bu nedenle önceden boyanmış protein standardını satın almak için çok fazla laboratuvar çeker.
Önceden lekelenmiş protein markerinin boya ile kovalent olarak birleştirildiğini belirtmek gerekir, bu nedenle göç özellikleri, farklı tampon koşulları altında elektrofores edildiğinde değişebilir, bu da bazı sapmalara yol açabilir, bu nedenle çoğu durumda, çoğu durumda, markör üzerindeki bantların hedef proteinle aynı olmayabileceği ve hedef protein aynı olmayabilir. Bununla birlikte, çoğu durumda, marker bantları hedef proteinimizle tam olarak aynı olmayabilir ve elde ettiğimiz, marker endikasyonuna göre sadece bir referans boyutudur ve sonuçta, benzer boyutlara sahip bantlar arasında ayrım yapmamız gerekmiyorsa, önceden lekelenmiş markör hala çok yararlıdır ve ayrıca, ayrıca çok yararlıdır ve ayrıca, ayrıca çok yararlıdır ve ayrıca kullanılabilir.
Prestined protein markerinin sınıflandırılması
Önceden lekelenmiş protein markeri: monokrom önceden boyanmış ve çok renkli önceden lekeli, tek renkli önceden lekeli protein markeri genellikle bazı bantların konsantrasyonunu, boyutlarının boyutunu önermek için belirli bantların konsantrasyonunu iki katına çıkarmak için kullanacaktır, böylece bireysel bantların boyutu arasında hızlı bir şekilde ezberleyebilir ve farklılaşabiliriz. Renk protein markerleri, daha da tanınabilir olan farklı renklerle ayırt edilir. Dahası, donuk bir elektroforez deneyinde renkli bir gökkuşağı işareti çıkarsa, ruh hali şu anda daha mutlu olacaktır!
Yukarıdakilere ek olarak, piyasada başka protein belirteçleri vardır: floresan protein belirteçleri, biyotinile belirteçler, gelişmiş protein belirteçleri vb.
Ek olarak, protein belirteçleri moleküler ağırlık aralığına göre yüksek moleküler ağırlık, düşük moleküler ağırlık ve geniş moleküler ağırlık olarak kategorize edilir. Yüksek moleküler ağırlık aralık belirteçleri genellikle büyük moleküler ağırlıklı proteinler için kullanılırken, küçük moleküler ağırlık aralık belirteçleri genellikle küçük proteinler veya hatta bazı peptitler için kullanılır. Tüm laboratuvarı düşünürseniz, daha düzgün bant dağılımına sahip geniş moleküler ağırlık belirteçleri seçin, böylece proteinleriniz hangi aralıkta olurlarsa olsunlar kolayca değerlendirilebilir.
Marker ile ilgili bazı sorunlar
Tüm belirteçlerin tükenmesi gerekiyor mu?
Örneğin, talimat kılavuzu 7 bant listeliyor, aslında 6 bant tüketmek normaldir, çalışma süresi yeterli değil, proteinin çok küçük değilse, elektroforez aparatını kapatmadan önce bromofenol mavi cephesinin jelden çıkmasını bekleyebilirsiniz, böylece 7 bant alabilmeniz gerekir. Bazen 5 bant olacaktır, ancak hedef proteininizin üst ve alt iki bandı tükenebildiği sürece, 7 bant olması gerekmez.
İşaretleyici gülen bir yüze dönüşürse ne yapmalıyım?
İlk olarak, jel basılmaz
İkincisi, tutkalın plakanın kenarındaki ve tutkalın merkezindeki akışkanlığı farklı olabilir, bunu yapmanın bir yolu yoktur, viskozite ve yüzey gerilimi ile. Çeşitli yöntemler yukarıdaki fenomeni çözemezse, örnek üzerindeki bir kanalı değiştirmek için kişisel tavsiye üreticisi, koşmak için yüzme şeridinin merkezine yakın bir şerit seçin.
Kenar efekti, numunenin iki şeridinin kenarında böyle olacaktır. Yavaş elektroforez hızını deneyebilirsiniz ......
Ya tutkal hazırlandığında iyi basılmaz, tutkal iyi hazırlanmaz veya elektroforez voltajı çok yüksektir, elektroosmotik kuvvet güçlüdür veya cam plaka elektroforez sırasında iyi kelepçelenmez ve iç elektroforez çözeltisi sızar, lütfen bunları teker teker kontrol edin.
Marker bantlarının genişletilmesi problemi nasıl çözülür?
Neden 1: Numunenin hacmi çok fazla, numune hacmi azaltılmalıdır.
Karşı Önlem: Numune hacmi, numune konsantrasyonu ve jel kalınlığına göre esnek bir şekilde kontrol edilmelidir. Genel olarak, numune hacmi 10-15μL'dir (yani 2-10μg protein). Numune çok seyreltilirse, numune hacmi 100μl'ye ulaşabilir.
Neden 2: Numunenin eksik çözünmesi.
Karşı önlemler:
(1) Numune tamamen çözülmelidir: her türlü protein numunesini koruyun ve işaretleyici örneklemeden önce tamamen çözülebilir, örneklemeden önce numuneyi santrifüj etmek ve çözülemeyen parçacıkları çıkarmak daha iyidir.
(2) moleküler ağırlık standartları için protein kitlerinin gereksinimlerine göre numune çözünme çözeltisi ilave edilebilir; Standart ve bilinmeyen numuneler kendi kendine yapılandırılmışsa, 0.5-1.0mg/L numune çözünme çözeltisini takip edin. Çözüldükten sonra, EP tüpüne aktarın, kapağı takın (kapağa bir klips ekleyebilirsiniz) ve daha sonra bir su banyosunda 3 dakika boyunca 110 derecede bir su banyosunda ısıtın (ince strafor plakasında EP tüpü ile aynı çaplı birkaç yuvarlak delik açabilirsiniz ve EP tüpü, daha fazla aşağı inen, daha sonra ince strafa koyulana kadar yerleştirilene kadar yerleştirebilirsiniz. Tüp, kaynar su banyosunda ve ince strafor plakası, kaynar su banyosunda doğal olarak yüzer, kaynar suyun yüzeyinde yüzer.
Farklı zamanlar için kaynar su banyosuna bir grup EP tüpü yerleştirilebilir. (EP tüplerini kaynar su banyosuna atmayın, kapaklar yıkanabilir) ve daha sonra kullanım için oda sıcaklığında soğutun. Numune daha uzun bir süre kullanılmıyorsa, numuneyi bir buzdolabında -20 santigrat derecede bir buzdolabında saklayın ve numuneyi oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 110 derece santigrat derecede kaynar suda ısıtın ve daha sonra kullanılmak üzere çıkarmadan önce soğutun.
(3) Numune tampon çözeltisini, numunenin tam olarak çözülebilmesi ve SDS miktarı yeterli olması için değiştirin.
Sebep: SDS bantları elektroforetik olarak komşu proteinlerle bağlantılıdır. Numunenin aşırı örneklenmesine ve eksik çözünmesine ek olarak, jelin numune kuyularının sızıntısı elektroforetik bantların genişlemesine neden olabilir. Sızıntı genellikle jel ve cam plaka arasındaki çatlaklardan kaynaklanır. Karşı önlemler: Şu anda, jel sadece yeniden hazırlanabilir, jel kohezyonu yukarı çekerken tarak dikkatli olmalı, hız çok hızlı olmamalı, yukarı çekme yönü jel yüzeyine dik olmalıdır; Jel ve jelin her iki tarafındaki cam plaka arasındaki çatlakları önlemek için, jel hazırlama işleminde jelin her iki tarafındaki cam plakayı sıkmayın.
