Protein Marker Tanımı ve Kullanımı
Protein İşaretleyici, protein bantlarının boyutunu belirtmek için bir 'cetvel' olarak kullanılan, moleküler ağırlığı bilinen proteinlerin bir karışımıdır.
Western Blot işleminde, moleküler ağırlık işaretleyicisi bir vida gibidir, küçük bir bağlantı olmasına rağmen, deney sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip olan o kadar küçük bir detaydır. İşaretleyicinin rolü esas olarak, moleküler ağırlığın boyutuna karşılık gelen protein bantlarının moleküler ağırlığını belirtmek için kullanılır ve yalnızca standart miktar doğru ve doğruysa, deneylerin sonuçları ikna edicidir, ayrıca protein İşaretleyici ayrıca zarın transfekte olup olmadığını da gösterir. Ayrıca membran transferinin başarılı olup olmadığını, proteinin jel üzerindeki elektroforez derecesini vb. gösterir. Dolayısıyla doğru protein markerinin seçilmesi de Western Blot deneylerinin başarısı için gerekli koşullardan biridir.
Protein Belirteçlerinin Sınıflandırılması
Genel olarak, en yaygın kullanılan protein belirteçleri, önceden lekelenmemiş protein belirteçleri ve önceden boyanmış protein belirteçleri olarak kategorize edilir.
Farklı boyutlardaki proteinlerin karşılaştırılması için uygun olan, bilinen moleküler ağırlığa sahip ve saflaştırılmış birkaç proteinin bir ön karışımıdır. Önceden boyanmamış Marker, önceden boyanmış Marker kadar iyi değildir çünkü elektroforez sırasında tamamen görünmezdir ve yalnızca elektroforezin sonunda protein boyamadan sonra gösterilebilir ve 'geriye dönük görüş' türüne ait olan deneysel süreçte referans olarak kullanılamaz. Ancak proteine bir boya molekülü veya işaretleyici molekül eşlik etmediği için gösterilen boyut, proteinin orijinal boyutuyla tam olarak aynı olduğundan daha doğrudur ve proteinin boyutunu daha doğru bir şekilde belirleyebilir.
Önceden Karıştırılmış İşaretleyici genellikle bir gösterge olarak konsantrasyonu iki katına çıkaran birkaç bant içerir, çünkü ne kadar çok bant karıştırılırsa hatırlamak o kadar kötü olur, hangisinin o olduğunu kim bilebilir! Gözleriniz bulanıklaşana kadar saymak zordur. Böylece özellikle konsantre olanları gördüğünüzde işaret bantları nerede olduklarını hatırlayacaktır. Ancak daha küçük bantların görülmesinin genellikle o kadar kolay olmadığını unutmayın. Seçim açısından elbette hedef proteininize benzer boyuttaki bantlardan en az birini seçmek en iyisidir, ne kadar yakınsa o kadar iyidir.
Önceden boyanmış Protein İşaretleyici, elektroforez veya membran transferi sırasında doğrudan gözlemlenebilen, bir boya ile kovalent bağlanma yoluyla birbirine karıştırılan bazı saflaştırılmış proteinlerdir.
Önceden boyanmış Protein İşaretleyicileri deneylerimiz için uygundur. Bu protein moleküler ağırlık standardı, elektroforezi izlememize ve elektroforez sırasında ve sonrasında ve ayrıca membran transferi sonrasında hareketliliği tahmin etmemize yardımcı olabilir - örneğin, dikey elektroforez için optimal çözünürlük bölgesinin jelden geçen yolun yaklaşık 2/3'ü olduğu biliniyorsa, önceden boyanmış bir Marker kullanarak şunları yapmak mümkündür. Örneğin, dikey elektroforezin optimal çözünürlük bölgesinin jelin yaklaşık 2/3'ü olduğu bilinmektedir; önceden boyanmış bir Marker kullanırsanız, hedef proteinin ne zaman geleceğini tahmin edebilirsiniz. optimum çözünürlük bölgesine girer ve optimum çözünürlük etkisini elde etmek için elektroforezi durdurur; İşaretleyicinin elektroforezinde bir anormallik gözlemlerseniz elektroforezi zamanında sonlandırabilirsiniz; Ayrıca Western Blot'ta membran transferinden sonra proteinin tamamen membrana aktarılıp aktarılmadığını gözlemleyebilir ve proteinin moleküler ağırlığını membran üzerinde etiketleyebilirsiniz, bu nedenle önceden boyanmış protein standardını satın almak için birçok laboratuvarın ilgisini çekmektedir.
Önceden boyanmış protein işaretleyicisinin boya ile kovalent olarak eşleştiğini, dolayısıyla farklı tampon koşulları altında elektroforezlendiğinde migrasyon özelliklerinin değişebileceğini, bu da bazı sapmalara yol açabileceğini, dolayısıyla proteinlerin kesin lokalizasyonu için uygun olmadığını belirtmekte fayda var - ancak çoğu durumda işaretleyici üzerindeki bantlar hedef proteinle aynı olmayabilir ve elde ettiğimiz sonuçlar hedef proteinle tamamen aynıdır. Ancak çoğu durumda Marker bantları hedef proteinimizle tam olarak aynı olmayabilir ve elde ettiğimiz şey sadece Marker göstergesine göre bir referans boyutudur ve sonuçta onu karakterize etmek için Western'e ihtiyacımız vardır, dolayısıyla benzer boyutlardaki bantlar arasında ayrım yapmamız gerekmiyorsa, önceden boyanmış Marker hala çok faydalıdır ve boyanmamış protein standardı ile birlikte de kullanılabilir.
Prestain Protein Markerinin Sınıflandırılması
Önceden boyanmış protein İşaretleyici şu şekilde ayrılır: tek renkli önceden boyanmış ve çok renkli önceden boyanmış, tek renkli önceden boyanmış protein İşaretleyici genellikle bazı bantları belirli bantların konsantrasyonunu iki katına çıkarmak için kullanır ve belirli bantların kalınlığını derinleştirerek boyutlarının boyutunu önerir, böylece bireysel bantların boyutunu hızlı bir şekilde ezberleyebilir ve aralarında ayrım yapabiliriz. Renkli protein belirteçleri, daha da tanınabilir olan farklı renklerle ayırt edilir. Üstelik donuk bir elektroforez deneyinde renkli bir gökkuşağı İşaretleyicisi ortaya çıkarsa, bu sefer ruh hali daha mutlu olacaktır!
Yukarıdakilere ek olarak piyasada başka protein İşaretleyici türleri de vardır: floresan protein İşaretleyicileri, biyotinlenmiş İşaretleyiciler, geliştirilmiş protein İşaretleyicileri vb.
Ayrıca protein Markerleri moleküler ağırlık aralığına göre yüksek moleküler ağırlıklı, düşük moleküler ağırlıklı ve geniş moleküler ağırlıklı olarak sınıflandırılır. Yüksek molekül ağırlığı aralığı İşaretleyicileri çoğunlukla büyük molekül ağırlığına sahip proteinler için kullanılırken, küçük molekül ağırlığı aralığı İşaretleyicileri sıklıkla küçük proteinler ve hatta bazı peptidler için kullanılır. tüm laboratuvarı düşünürseniz, daha düzgün bant dağılımına sahip geniş moleküler ağırlık İşaretleyicilerini seçin, böylece proteinleriniz hangi aralıkta olursa olsun kolayca değerlendirilebilir.
Marker'la ilgili bazı sorunlar
Örneğin kullanım kılavuzunda 7 bant listeleniyor aslında 6 bandın bitmesi normal, çalışma süresi yeterli olmayabilir, eğer proteininiz çok küçük değilse elektroforez aparatını kapatmadan önce bromofenol mavisi cephesinin jelden bitmesini bekleyebilirsiniz, böylece 7 bant elde edebilmelisiniz. Bazen 5 bant olabilir ama hedef proteininizin üst ve alt iki bandı tükenebildiği sürece 7 bant olmasına gerek yoktur.
Öncelikle jele basılmıyor
İkincisi, plakanın kenarı ile tutkalın ortasındaki tutkalın akışkanlığı farklı olabilir, viskozite ve yüzey gerilimi ile bunu yapmanın bir yolu yoktur. Yukarıdaki fenomeni çeşitli yöntemler çözemezse, kişisel tavsiye yapıcı örnekteki bir kanalı değiştirmeli ve koşuyu gerçekleştirmek için yüzme şeridinin merkezine yakın bir şerit seçmelidir.
Kenar efekti, numunenin iki şeridinin kenarında şu şekilde olacaktır. Daha yavaş elektroforez hızını deneyebilirsiniz ......
Ya tutkal hazırlanırken iyi preslenmemiş, ya tutkal iyi hazırlanmamış, ya da elektroforez voltajı çok yüksek, elektroozmotik kuvvet güçlü, ya da elektroforez sırasında cam plaka iyi sıkıştırılmamış ve iç elektroforez çözeltisi sızdırıyor, lütfen bunları tek tek kontrol edin.
Sebep 1: Numune hacmi çok fazla, numune hacmi azaltılmalıdır.
Karşı önlem: Numune hacmi, numune konsantrasyonuna ve jel kalınlığına göre esnek bir şekilde kontrol edilmelidir. Genellikle numune hacmi 10-15μL'dir (yani 2-10μg protein). Numune çok seyreltilmişse numune hacmi 100μL’ye ulaşabilir.
Neden 2: Numunenin eksik çözünmesi.
Karşı önlemler:
(1) Numune tamamen çözülmelidir: her türlü protein numunesini saklayın ve Marker, numune almadan önce tamamen çözülebilir, numuneyi numune almadan önce santrifüjlemek ve çözünemeyen parçacıkları çıkarmak daha iyidir.
(2) Moleküler ağırlık standartlarına yönelik protein kitlerinin gerekliliklerine göre numune çözünme çözeltisi eklenebilir; standart ve bilinmeyen numuneler kendiliğinden yapılandırılmışsa 0,5-1,0 mg/L numune çözünme solüsyonunu izleyin. Çözündükten sonra, Ep tüpüne aktarın, kapağını takın (kapağa bir klip ekleyebilirsiniz) ve ardından 110 santigrat derecede bir su banyosunda 3 dakika ısıtın (ince Strafor plakaya Ep tüpüyle aynı çapta birkaç yuvarlak delik açabilirsiniz ve Ep tüpü, kapağın kenarının daha fazla aşağı inmesi kısıtlanıncaya kadar aşağı indirilir ve ardından Ep tüpünün gövdesinin çoğunu açığa çıkaran ince Strafor plakayı yerleştirin, Kaynayan su banyosunda ince Strafor levha doğal olarak kaynar su banyosunda yüzer. İnce Strafor levha kaynar suyun yüzeyinde doğal olarak yüzer, erişim ve ısıtmayı kolaylaştırır ve kaynayan suyun sıçramasını önler.
Kaynayan su banyosuna farklı zamanlarda bir dizi Ep tüpü yerleştirilebilir. (Ep tüplerini kaynar su banyosuna atmayın, kapakları yıkanabilir) ve ardından kullanım için oda sıcaklığında soğutun. Numune daha uzun süre kullanılmayacaksa, numuneyi -20 santigrat derecede buzdolabında saklayın ve gerektiğinde numuneyi 110 santigrat derecede kaynar suda oda sıcaklığında 3 dakika ısıtın ve kullanmak için çıkarmadan önce soğutun ve ardından numune proteinlerindeki yarı stabil agregatları çıkarmak için numuneyi uygulayın.
(3) Numunenin tamamen çözünebilmesi ve SDS miktarının yeterli olması için numune tampon çözeltisini değiştirin.
Sebep: SDS bantları komşu proteinlere elektroforetik olarak bağlıdır. Aşırı örnekleme ve numunenin eksik çözünmesine ek olarak, jelin numune kuyucuklarından sızıntı, elektroforetik bantların genişlemesine neden olabilir. Sızıntıya genellikle jel ile cam plaka arasındaki çatlaklar neden olur. Karşı önlemler: Bu sırada jel ancak yeniden hazırlanabilir, tarak dikkatli bir şekilde yukarı çekilirken jelin yapışması tamamlanmalıdır, hız çok hızlı olmamalıdır, yukarı çekme yönü jelin yüzeyine dik olmalıdır; Jelin her iki tarafındaki cam plaka ile jel arasında çatlakları önlemek için, jel hazırlama işlemi sırasında jelin her iki tarafındaki cam plakayı sıkmayın.
