علامة البروتين | كيفية الاختيار | تحليل المشكلة

تعريف علامة البروتين واستخدامها

علامة البروتين عبارة عن خليط من البروتينات ذات الوزن الجزيئي المعروف، والتي تستخدم بمثابة 'مسطرة' للإشارة إلى حجم أشرطة البروتين.

في عملية اللطخة الغربية، تكون علامة الوزن الجزيئي مثل المسمار، على الرغم من أنها رابط صغير، إلا أنها تفاصيل صغيرة لها تأثير كبير على النتائج التجريبية. يستخدم دور العلامة بشكل أساسي للإشارة إلى الوزن الجزيئي لنطاقات البروتين المقابلة لحجم الوزن الجزيئي، وفقط إذا كانت الكمية القياسية دقيقة وصحيحة، تكون نتائج التجارب مقنعة، بالإضافة إلى أن علامة البروتين توضح أيضًا ما إذا كان الغشاء مصابًا بالعدوى أم لا. بالإضافة إلى ذلك، فهو يوضح أيضًا ما إذا كان نقل الغشاء ناجحًا أم لا، ودرجة الرحلان الكهربائي للبروتين على الجل، وما إلى ذلك. لذلك، يعد اختيار علامة البروتين المناسبة أيضًا أحد الشروط الضرورية لنجاح تجارب Western Blot.

تصنيف علامات البروتين

بشكل عام، يتم تصنيف علامات البروتين الأكثر استخدامًا إلى علامات بروتين غير ملطخة مسبقًا وعلامات بروتين ملطخة مسبقًا.

• علامة البروتين غير الملطخة مسبقًا

وهو عبارة عن مزيج مسبق من العديد من البروتينات ذات الوزن الجزيئي المعروف والمنقى، وهو مناسب لمقارنة البروتينات ذات الأحجام المختلفة. علامة غير ملطخة ليست جيدة مثل علامة ملطخة مسبقا لأنها غير مرئية تماما أثناء الرحلان الكهربائي، ولا يمكن الإشارة إليها إلا بعد تلطيخ البروتين في نهاية الرحلان الكهربي، ولا يمكن استخدامها كمرجع في العملية التجريبية، التي تنتمي إلى نوع 'الإدراك المتأخر'. ومع ذلك، نظرًا لأن البروتين لا يرافقه جزيء صبغة أو جزيء علامة، فإن الحجم الموضح هو بالضبط الحجم الأصلي للبروتين، لذلك فهو أكثر دقة ويمكنه تحديد حجم البروتين بدقة.

عادة ما يحتوي قلم التحديد المختلط مسبقًا على عدد قليل من الأشرطة التي تضاعف التركيز كمؤشر، لأنه كلما زاد عدد الأشرطة المختلطة، كلما كان تذكرها أسوأ، من يدري أي منها هو هذا! من الصعب العد حتى تصبح عيناك غير واضحة. لذلك عندما ترى تلك التركيزات بشكل خاص، ستتذكر أشرطة التحديد مكانها. تذكر رغم ذلك أن النطاقات الأصغر عادة لا تكون سهلة الرؤية. فيما يتعلق بالاختيار، بالطبع، من الأفضل اختيار واحدة على الأقل من النطاقات المشابهة في الحجم للبروتين المستهدف، وكلما اقتربت كلما كان ذلك أفضل.

• علامة البروتين المُثبتة

علامة البروتين الملطخة مسبقًا هي بعض البروتينات النقية المخلوطة معًا عن طريق الاقتران التساهمي مع الصبغة، والتي يمكن ملاحظتها مباشرة أثناء النقل الكهربائي أو نقل الغشاء.

تعتبر علامات البروتين الملطخة مسبقًا مناسبة لتجاربنا. يمكن أن يساعدنا معيار الوزن الجزيئي للبروتين في مراقبة الرحلان الكهربي وتقدير الحركة أثناء وبعد الرحلان الكهربي، وكذلك بعد نقل الغشاء - على سبيل المثال، إذا كان من المعروف أن منطقة الدقة المثالية للرحلان الكهربي العمودي هي حوالي 2/3 من الطريق عبر الجل، باستخدام علامة ملطخة مسبقًا، فمن الممكن. التنبؤ بموعد دخول البروتين المستهدف إلى منطقة الدقة المثلى وإيقاف الرحلان الكهربائي من أجل الحصول على تأثير الدقة الأمثل؛ يمكنك أيضًا إنهاء الرحلان الكهربي في الوقت المناسب إذا لاحظت وجود خلل في الرحلان الكهربي للعلامة؛ بالإضافة إلى ذلك، يمكنك ملاحظة ما إذا كان البروتين قد تم نقله بالكامل إلى الغشاء بعد نقل الغشاء في اللطخة الغربية ويمكنك تحديد الوزن الجزيئي للبروتين على الغشاء، وهذا هو السبب في أنه يجذب الكثير من المختبرات لشراء معيار البروتين الملون مسبقًا.

تجدر الإشارة إلى أن علامة البروتين الملطخة مسبقًا تقترن تساهميًا بالصبغة، لذلك قد تتغير خصائص الهجرة عند النقل الكهربي في ظل ظروف عازلة مختلفة، مما قد يؤدي إلى بعض الانحرافات، لذا فهي غير مناسبة للتوطين الدقيق للبروتينات - ومع ذلك، في معظم الحالات، قد لا تكون النطاقات الموجودة على العلامة مطابقة للبروتين المستهدف، والنتائج التي نحصل عليها هي نفس البروتين المستهدف. ومع ذلك، في معظم الحالات، قد لا تكون نطاقات العلامات مطابقة تمامًا للبروتين المستهدف، وما نحصل عليه هو مجرد حجم مرجعي بالنسبة لمؤشر العلامة، وفي النهاية، نحتاج إلى غربي لتوصيفه، لذلك إذا لم نكن بحاجة إلى التمييز بين النطاقات ذات الأحجام المتشابهة، فإن العلامة الملطخة مسبقًا لا تزال مفيدة جدًا، ويمكن استخدامها أيضًا جنبًا إلى جنب مع معيار البروتين غير الملوث.

تصنيف علامة البروتين الملوثة

ينقسم بروتين ماركر المُلون مسبقًا إلى: بروتين أحادي اللون مُلون مسبقًا ومتعدد الألوان، وسيستخدم بروتين ماركر أحادي اللون عادةً بعض النطاقات لمضاعفة تركيز نطاقات معينة لتعميق سمك نطاقات معينة لاقتراح حجم حجمها، حتى نتمكن من حفظ حجم النطاقات الفردية والتمييز بينها بسرعة. تتميز علامات البروتين الملونة بألوان مختلفة، والتي يمكن التعرف عليها بشكل أكبر. علاوة على ذلك، إذا ظهر قلم تحديد قوس قزح ملون في تجربة رحلان كهربائي باهتة، فسيكون المزاج أكثر سعادة في هذا الوقت!

بالإضافة إلى ما سبق، هناك بعض الأنواع الأخرى من علامات البروتين في السوق: علامات البروتين الفلوري، وعلامات البروتين المعززة بالبيوتينيل، وعلامات البروتين المطورة، وما إلى ذلك....

بالإضافة إلى ذلك، يتم تصنيف علامات البروتين إلى وزن جزيئي مرتفع ووزن جزيئي منخفض ووزن جزيئي واسع وفقًا لنطاق الوزن الجزيئي. غالبًا ما تُستخدم علامات نطاق الوزن الجزيئي المرتفع للبروتينات ذات الوزن الجزيئي الكبير، بينما تُستخدم علامات نطاق الوزن الجزيئي الصغير غالبًا للبروتينات الصغيرة أو حتى بعض الببتيدات. إذا نظرت إلى المختبر بأكمله، فاختر علامات الوزن الجزيئي الواسعة مع توزيع نطاق أكثر اتساقًا، بحيث يمكن الحكم على البروتينات بسهولة بغض النظر عن الفاصل الزمني الذي توجد فيه.

بعض المشاكل مع ماركر

• هل يجب أن تنفد جميع العلامات؟

على سبيل المثال، يسرد دليل التعليمات 7 نطاقات، في الواقع، من الطبيعي أن ينفد 6 نطاقات، قد يكون وقت التشغيل غير كافٍ، إذا لم يكن البروتين الخاص بك صغيرًا جدًا، يمكنك الانتظار حتى تنفد واجهة البروموفينول الزرقاء من الجل قبل إيقاف تشغيل جهاز الرحلان الكهربائي، حتى تتمكن من الحصول على 7 نطاقات. في بعض الأحيان سيكون هناك 5 نطاقات، ولكن طالما يمكن نفاد النطاقين العلوي والسفلي من البروتين المستهدف، فليس من الضروري أن يكون 7 نطاقات.

• ماذا علي أن أفعل إذا تحول العلامة إلى وجه مبتسم؟

أولاً، لا يتم ضغط الجل

ثانيا، قد تكون سيولة الغراء عند حافة اللوحة ومركز الغراء مختلفة، ولا توجد طريقة للقيام بذلك، مع اللزوجة والتوتر السطحي. إذا لم تتمكن مجموعة متنوعة من الأساليب من حل الظاهرة المذكورة أعلاه، فيجب على صانع النصائح الشخصية تغيير القناة في العينة واختيار حارة قريبة من وسط حارة السباحة لتشغيل الجري.

تأثير الحافة، على حافة المسارين للعينة سيكون هكذا. يمكنك تجربة سرعة أبطأ للرحلان الكهربائي ......

إما أن الغراء لم يتم ضغطه جيدًا عند تحضيره، أو أن الغراء لم يتم إعداده جيدًا، أو أن جهد الرحلان الكهربي مرتفع جدًا، أو أن القوة التناضحية الكهربائية قوية، أو أن اللوحة الزجاجية لم يتم تثبيتها جيدًا أثناء الرحلان الكهربي، وأن محلول الرحلان الكهربي الداخلي يتسرب، يرجى التحقق منها واحدًا تلو الآخر.

• كيفية حل مشكلة توسيع نطاقات العلامات؟

السبب 1: حجم العينة كبير جدًا، ويجب تقليل حجم العينة.

الإجراء المضاد: يجب التحكم في حجم العينة بمرونة وفقًا لتركيز العينة وسمك الجل. بشكل عام، حجم العينة هو 10-15 ميكرولتر (أي 2-10 ميكروجرام من البروتين). إذا كانت العينة مخففة للغاية، يمكن أن يصل حجم العينة إلى 100 ميكرولتر.

السبب 2: الذوبان غير الكامل للعينة.

التدابير المضادة:

(1) يجب أن تذوب العينة بالكامل: احتفظ بجميع أنواع عينات البروتين ويمكن إذابة العلامة بالكامل قبل أخذ العينات، ومن الأفضل طرد العينة قبل أخذ العينات وإزالة الجزيئات التي لا يمكن إذابتها.

(2) يمكن إضافة محلول ذوبان العينة وفقًا لمتطلبات مجموعات البروتين لمعايير الوزن الجزيئي؛ إذا كانت العينات القياسية وغير المعروفة تم تكوينها ذاتيًا، فاتبع محلول ذوبان العينة بنسبة 0.5-1.0 ملجم/لتر. بعد الذوبان، انقله إلى أنبوب Ep، ضع الغطاء (يمكنك إضافة مشبك عند الغطاء) ثم قم بتسخينه في حمام مائي عند 110 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (يمكنك حفر عدة ثقوب مستديرة بنفس قطر أنبوب Ep في لوحة الستايروفوم الرقيقة، ويتم وضع أنبوب Ep حتى يتم منع حافة الغطاء من النزول أكثر، ثم ضع لوحة الستايروفوم الرقيقة، التي تكشف معظم جسم أنبوب Ep، في حمام الماء المغلي، وتطفو لوحة الستايروفوم الرقيقة بشكل طبيعي في حمام الماء المغلي. تطفو لوحة الستايروفوم الرقيقة بشكل طبيعي على سطح الماء المغلي، مما يسهل الوصول إليها وتسخينها، وتجنب تناثر الماء المغلي.

يمكن وضع مجموعة من أنابيب Ep في حمام الماء المغلي لأوقات مختلفة. (لا تقم بإلقاء أنابيب Ep في حمام الماء المغلي، فقد يتم غسل الأغطية) ثم تبرد في درجة حرارة الغرفة للاستخدام. إذا لم يتم استخدام العينة لفترة أطول، قم بتخزين العينة في الثلاجة عند -20 درجة مئوية، وعند الحاجة، قم بتسخين العينة في الماء المغلي عند 110 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بتبريدها قبل إزالتها للاستخدام ثم تطبيق العينة لإزالة الركام القابل للتحلل في بروتينات العينة.

(3) قم بتغيير المحلول المنظم للعينة بحيث يمكن إذابة العينة بالكامل ويجب أن تكون كمية SDS كافية.

السبب: ترتبط نطاقات SDS كهربائيًا بالبروتينات المجاورة. بالإضافة إلى الإفراط في أخذ العينات والانحلال غير الكامل للعينة، يمكن أن يؤدي تسرب آبار العينة من الجل إلى اتساع نطاقات الرحلان الكهربي. غالبًا ما يحدث التسرب بسبب الشقوق الموجودة بين الجل واللوحة الزجاجية. التدابير المضادة: في هذا الوقت، لا يمكن إعادة تحضير الجل إلا، ويجب أن يكون المشط حذرًا عند اكتمال تماسك الجل، ويجب ألا تكون السرعة سريعة جدًا، ويجب أن يكون اتجاه السحب عموديًا على سطح الجل؛ لتجنب التشققات بين اللوحة الزجاجية على جانبي الجل والهلام، لا تضغط على اللوحة الزجاجية على جانبي الجل أثناء عملية تحضير الجل.