علامة البروتين | كيفية اختيار | تحليل المشكلة

تعريف علامة البروتين والاستخدام

علامة البروتين عبارة عن مزيج من البروتينات ذات الوزن الجزيئي المعروف ، والذي يستخدم كحاكم 'للإشارة إلى حجم نطاقات البروتين.

في عملية لطخة غربية ، تشبه علامة الوزن الجزيئي مثل المسمار ، على الرغم من أنها رابط صغير ، إلا أنه من التفاصيل الصغيرة التي لها تأثير كبير على النتائج التجريبية. يتم استخدام دور العلامة بشكل أساسي للإشارة إلى الوزن الجزيئي للتجريبية أيضًا ، بالإضافة إلى ذلك ، فإن النتائج الجزيئية تُعرض ما إذا كانت العلامات الجزيئية تقترن أيضًا بالتجريبية ، بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تتمثل في الإضفاء الغشاء ينقل أم لا. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوضح أيضًا ما إذا كان نقل الغشاء ناجحًا أم لا ، ودرجة الكهربية من البروتين على الهلام ، وما إلى ذلك. لذلك ، يعد اختيار علامة البروتين الصحيحة أحد الحالات اللازمة لنجاح تجارب لطخة غربية.

تصنيف علامات البروتين

بشكل عام ، يتم تصنيف علامات البروتين الأكثر استخدامًا إلى علامات البروتين غير الملوثة وعلامات البروتين مسبقًا.

• علامة البروتين غير ملطخة

إنه موجز للعديد من البروتينات ذات الوزن الجزيئي المعروف وتنقية ، وهو مناسب لمقارنة البروتينات ذات الأحجام المختلفة. العلامة غير الملوثة غير الملوثة ليست جيدة مثل العلامة المسبقة مسبقًا لأنها غير مرئية تمامًا أثناء الكهربائي ، ولا يمكن الإشارة إليها إلا بعد تلطيخ البروتين في نهاية الرحلان الكهربائي ، ولا يمكن استخدامها كمرجع في العملية التجريبية ، والتي تنتمي إلى نوع 'londsight '. ومع ذلك ، نظرًا لأن البروتين لا يرافقه جزيء صبغ أو جزيء علامة ، فإن الحجم الموضح هو بالضبط الحجم الأصلي للبروتين ، لذلك يكون أكثر دقة ويمكنه تحديد حجم البروتين بدقة.

عادةً ما يكون لدى العلامة المدمجة مسبقًا عدد قليل من النطاقات التي تضاعف التركيز كدليل ، لأن المزيد من النطاقات مختلطة ، كلما كان ذلك أسوأ من ذلك ، من يعرف أي واحد! من الصعب الاعتماد حتى تصبح عينيك غير واضحة. لذلك عندما ترى تلك المركزة بشكل خاص ، ستتذكر نطاقات العلامات مكانها. تذكر أن النطاقات الأصغر لا تكون سهلة رؤيتها عادة. فيما يتعلق بالاختيار ، بالطبع ، من الأفضل اختيار واحد على الأقل من الفرق الموسيقية المتشابهة في الحجم مع البروتين المستهدف ، كلما كان ذلك أفضل.

• علامة البروتين الإجهاد

علامة البروتين مسبقًا هي بعض البروتينات المنقى التي تم خلطها معًا بواسطة اقتران تساهمي مع صبغة ، والتي يمكن ملاحظتها مباشرة أثناء نقل الكهربائي أو نقل الغشاء.

علامات البروتين مسبقة مسبقًا مريحة لتجاربنا. يمكن أن يساعدنا معيار الوزن الجزيئي البروتيني هذا في مراقبة التحول الكهربائي وتقدير التنقل أثناء وبعد الإلكتروكات الكهربائية ، وكذلك بعد نقل الغشاء - على سبيل المثال ، إذا كان من المعروف أن المنطقة الأمثل للدقة للكهرباء الرأسية هي حوالي 2/3 من الطريق من خلال الجيل ، باستخدام العلامة المسبقة مسبقًا ، فمن الممكن على سبيل المثال ، على سبيل المثال ، أن تكون القديرة المحسنة من الطريق السريع ، فهي تُعرف عن ذلك ، فهذا أمر تم تحديده من ذلك. استخدم علامة مسبقة مسبقًا ، يمكنك التنبؤ عندما يدخل البروتين المستهدف إلى منطقة الدقة الأمثل ويوقف الرحلان الكهربائي من أجل الحصول على تأثير الدقة الأمثل ؛ يمكنك أيضًا إنهاء الكهربائي في الوقت المناسب إذا لاحظت وجود خلل في الكهربائي في العلامة ؛ بالإضافة إلى ذلك ، يمكنك ملاحظة ما إذا كان البروتين يتم نقله تمامًا إلى الغشاء بعد نقل الغشاء في اللطخة الغربية ويمكنك تسمية الوزن الجزيئي للبروتين على الغشاء ، وهذا هو السبب في أنه يجذب الكثير من المختبرات لشراء معيار البروتين مسبقًا.

تجدر الإشارة إلى أن علامة البروتين مسبقًا مقترنة تساهميًا بالصبغة ، وبالتالي فإن خصائص الترحيل قد تتغير عندما تكون كهربائيًا في ظل ظروف مخزنة مختلفة ، والتي قد تؤدي إلى بعض الانحرافات ، لذلك قد لا تكون مناسبة للترجمات الدقيقة للبروتينات - في معظم الحالات ، قد لا تكون النطاقات الموجودة على العلامة متطابقة مع البروتين المستهدف ، والنتائج التي نتحملها فقط. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، قد لا تكون نطاقات العلامات هي نفسها تمامًا مثل البروتين المستهدف لدينا ، وما نحصل عليه هو مجرد حجم مرجعي بالنسبة لمؤشر العلامة ، وفي النهاية ، نحتاج إلى الغربية لتوصيفه ، لذلك إذا لم نحتاج إلى التمييز بين نطاقات الأحجام المماثلة ، فإن العلامة التي تم تخطيها مسبقًا لا تزال مفيدة للغاية ، ويمكن أيضًا استخدامها بالتواصل مع البروتين غير المرتبط.

تصنيف علامة البروتين المبللة

تنقسم علامة البروتين مسبقًا مسبقًا إلى: عادةً ما تستخدم علامة البروتين أحادية اللون مسبقًا مسبقًا ومتعددة الألوان ، وعادة ما تستخدم بعض النطاقات لمضاعفة تركيز بعض النطاقات لتعميق سمك بعض النطاقات لتوحي بحجم حجمها ، حتى نتمكن من حفظها بسرعة وتميز بين حجم الفرقة الفردية. تتميز علامات البروتين الملونة بألوان مختلفة ، والتي يمكن التعرف عليها. علاوة على ذلك ، إذا ظهرت علامة قوس قزح ملونة في تجربة كهربائية مملة ، فسيكون المزاج أكثر سعادة في هذا الوقت!

بالإضافة إلى ما سبق ، هناك بعض أنواع علامات البروتين الأخرى في السوق: علامات البروتين الفلوري ، وعلامات البيوتينيلات ، وعلامات البروتين المطورة ، إلخ ...

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصنيف علامات البروتين إلى الوزن الجزيئي العالي ، والوزن الجزيئي المنخفض والوزن الجزيئي الواسع وفقًا لنطاق الوزن الجزيئي. غالبًا ما تستخدم علامات نطاق الوزن الجزيئي العالي لبروتينات الوزن الجزيئي الكبيرة ، بينما تستخدم علامات نطاق الوزن الجزيئي الصغيرة في البروتينات الصغيرة أو حتى بعض الببتيدات. إذا كنت تفكر في المختبر بأكمله ، فاختر علامات الوزن الجزيئي الواسع مع توزيع أكثر اتساقًا على نطاق النطاق ، بحيث يمكن الحكم على البروتينات الخاصة بك بسهولة بغض النظر عن الفترة الفاصلة التي تكون فيها.

بعض المشاكل مع علامة

• هل يجب أن تنفد جميع العلامات؟

على سبيل المثال ، يسرد دليل التعليمات 7 نطاقات ، في الواقع ، من الطبيعي أن تنفد 6 نطاقات ، قد يكون وقت التشغيل لا يكفي ، إذا لم يكن البروتين صغيرًا جدًا ، فيمكنك الانتظار حتى تنفد الجبهة الزرقاء البروموفينول من الجل قبل إيقاف تشغيل جهاز الكهرباء ، بحيث تكون قادرًا على الحصول على 7 أشرطة. في بعض الأحيان ، سيكون هناك 5 نطاقات ، ولكن طالما يمكن أن ينفد الشريطين العلوي والسفلي من البروتين المستهدف ، لا يجب أن يكون 7 نطاقات.

• ماذا علي أن أفعل إذا تحولت العلامة إلى وجه مبتسم؟

أولاً ، لا يتم الضغط على الجل

ثانياً ، قد تكون سيولة الغراء على حافة اللوحة ومركز الغراء مختلفًا ، ولا توجد طريقة للقيام بذلك ، مع اللزوجة والتوتر السطحي. إذا لم تتمكن مجموعة متنوعة من الطرق من حل الظاهرة المذكورة أعلاه ، فإن صانع النصائح الشخصية لتغيير قناة على العينة ، فاختر حارة بالقرب من مركز مسار السباحة لتشغيل الجري.

تأثير الحافة ، على حافة ممرتين من العينة سيكون هكذا. يمكنك محاولة أبطأ سرعة الكهرباء ......

إما أن الغراء ليس مضغوطًا جيدًا عند تحضيره ، أو أن الغراء غير مستعد جيدًا ، أو أن الجهد الكهربائي مرتفع للغاية ، أو أن القوة الكهربية قوية ، أو أن اللوحة الزجاجية لا يتم تثبيتها بشكل جيد أثناء الكهربائي ، ومحلول الكهرباء الداخلية يتسرب ، يرجى التحقق منها واحدًا تلو الآخر.

• كيف تحل مشكلة توسيع نطاق العلامات؟

السبب 1: حجم العينة أكثر من اللازم ، يجب تقليل حجم العينة.

الإجراء المضاد: يجب التحكم في حجم العينة بمرونة وفقًا لتركيز العينة وسمك الهلام. بشكل عام ، يكون حجم العينة 10-15 ميكرولتر (أي 2-10 ميكروغرام من البروتين). إذا كانت العينة مخففة للغاية ، يمكن أن يصل حجم العينة إلى 100 ميكرولتر.

السبب 2: حل غير مكتمل للعينة.

التدابير المضادة:

(1) يجب إذابة العينة بالكامل: احتفظ بجميع أنواع عينات البروتين والعلامة يمكن حلها بالكامل قبل أخذ العينات ، من الأفضل أن تطرد العينة قبل أخذ العينات ، وإزالة الجسيمات التي لا يمكن حلها.

(2) يمكن إضافة محلول حل العينة وفقًا لمتطلبات مجموعات البروتين لمعايير الوزن الجزيئي ؛ إذا كانت العينات القياسية وغير المعروفة تهيئًا ذاتيًا ، اتبع محلول حل العينة 0.5-1.0mg/L. بعد الذوبان ، قم بنقله إلى أنبوب EP ، ووضع الغطاء على (يمكنك إضافة مقطع عند الغطاء) ثم تسخنه في حمام مائي على درجة حرارة 110 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (يمكنك الحفر عدة ثقوب مستديرة مع قطر نفس قطر EP في صفيحة الرقيقة ، ويتم وضعها في اللوحة الرقيقة. الأنبوب ، في حمام الماء المغلي ، وتطفو لوحة الستايروفوم الرقيقة بشكل طبيعي في حمام الماء المغلي.

يمكن وضع مجموعة من أنابيب EP في حمام الماء المغلي لأوقات مختلفة. (لا ترمي أنابيب EP في حمام الماء المغلي ، يمكن غسل الأغطية) ثم تبرد في درجة حرارة الغرفة للاستخدام. إذا لم يتم استخدام العينة لفترة أطول من الوقت ، فقم بتخزين العينة في الثلاجة على درجة حرارة -20 درجة مئوية ، وعند الحاجة ، قم بتسخين العينة في الماء المغلي عند 110 درجة مئوية لمدة 3 دقائق عند درجة حرارة الغرفة وتبريدها قبل إزالتها للاستخدام ثم تطبيق العينة لإزالة التجميعات البديلة في البروتينات العينة.

(3) قم بتغيير محلول المخزن المؤقت للعينة بحيث يمكن حل العينة بالكامل ويجب أن تكون كمية SDs كافية.

السبب: ترتبط نطاقات SDS بالكهربي بالبروتينات المجاورة. بالإضافة إلى الإفراط في أخذ العينات والانحلال غير المكتمل للعينة ، يمكن أن يتسبب تسرب آبار عينة الهلام في توسيع نطاق الأشرطة الكهربية. غالبًا ما يكون التسرب ناتجًا عن التشققات بين الجل واللوحة الزجاجية. التدابير المضادة: في هذا الوقت ، لا يمكن إعادة استعداد الهلام إلا ، يجب أن يكون المشط حذرًا عند الانتهاء من تماسك الهلام ، يجب ألا تكون السرعة سريعة جدًا ، وينبغي أن يكون اتجاه السحب عموديًا على سطح الهلام ؛ لتجنب الشقوق بين اللوحة الزجاجية على جانبي الهلام والهلام ، لا تضغط على اللوحة الزجاجية على جانبي الجل في عملية تحضير الهلام.