Прегледа: 0 Аутор: Едитор сајта Објавите време: 2023-08-21 Порекло: Сајт
Дефиниција и употреба маркера протеина
Протеински маркер је мешавина протеина познате молекуларне тежине, која се користи као 'владар ' да означи величину протеинских бендова.
In the process of Western Blot, the molecular weight marker is like a screw, although it is a small link, however, it is such a small detail that has a significant effect on the experimental results.The role of the marker is mainly used to indicate the molecular weight of the protein bands corresponding to the size of the molecular weight, and only if the standard amount of accurate and correct, the results of the experiments are convincing, in addition to protein Marker also shows whether мембрана је трансфектирана или не. Поред тога, то такође показује да ли је пренос мембране успешан или не, а степен електрофорезе протеина на гелу итд. Стога је одабрао праву протеину један од неопходних услова за успех експеримената западног блота.
Класификација протеинских маркера
Генерално, најчешће коришћени протеински маркери сврставају се у не-прекраћене протеинске маркере и претходно обојене протеине.
Неокраћени маркер протеина
То је премикс неколико протеина познате молекулске тежине и пречишћено, што је погодно за поређење протеина различитих величина. Неокраћени маркер није толико добар као и пре-обојени маркер, јер је потпуно невидљив током електрофорезе и може се навести само након бојења протеина на крају електрофорезе и не може се користити као референцу у експерименталном процесу, што припада тип 'прегледи'. Међутим, пошто протеин није праћен молекулом боје или молекула маркера, приказана величина је тачно оригинална величина протеина, тако да је тачнија и може тачно да утврди величину протеина.
Пре-мешовити маркер обично има неколико бендова који удвостручује концентрацију као индикацију, јер се више бендова меша, што је још горе запамтити, ко зна који је то онај! Тешко је пребројати док се очи не замагне. Дакле, када видите, посебно концентрисани, маркерски траци ће се сетити где су. Запамтите, ипак, мањи бендови обично нису тако лако видети. У погледу селекције, наравно, најбоље је да одаберете бар један од бендова који су сличне величине вашег циљног протеина, ближе је боље.
Престенирани протеин маркер
Претходни маркер протеина је неки пречишћени протеини помешани ковалентни спојница са бојом, који се може директно посматрати током електрофорезе или мембранског преноса.
Претјечене маркери протеина су погодни за наше експерименте. Овај стандард молекуларне тежине протеина може нам помоћи да надгледамо електрофорезу и процену мобилност током и после електрофорезе, као и након мембранског преноса - на пример, ако је то познато да је оптимална зона резолуције за вертикалну електрофорезу, користећи пренатељујуће зоне резолуције, на пример, то је потребно да је оптимална зона вертикалне електрофорезе. Користите претходно обојени маркер, можете предвидети када циљни протеин уђе у зону оптималне резолуције и заустави електрофорезу како би се добио оптимални ефекат резолуције; Такође можете да престанете електрофорезу у време ако поштујете абнормалност у електрофорези маркера; Поред тога, можете да поштујете да ли се протеин потпуно преноси у мембрану након преноса мембране у западном блоту и можете да означите молекуларну тежину протеина на мембрани, због чега привлачи пуно лабораторија за куповину пренатељаног стандарда протеина.
Вриједно је напоменути да је пре-витрани протеински маркер ковалентно спојен са бојом, тако да се миграционе карактеристике могу променити када је електрофорирана у различитим условима међуспремника, тако да није погодна за прецизну локализацију протеина, али у већини случајева бендови на маркеру не могу бити идентични циљаним протеином. Међутим, у већини случајева маркери могу бити потпуно исти као на наш циљни протеин и оно што добијамо је само референтна величина у односу на индикацију маркера, а на крају нам је потребно да га окарактеришемо, па ако нам не треба да разликујемо бендове сличних величина, и може се користити и у комбинацији и у комбинацији је и у комбинацији.
Класификација престераних маркера протеина
Претјечени маркер протеина је подељен на: једнобојни пре-обојени и вишебојни предомрвљини, једнобојни пренагласни протеински маркер обично користиће неке бендове да удвоструче концентрацију одређених бендова да продубљују дебљину одређених бендова да би предложили величину њихове величине, тако да можемо брзо памтити и разликовати величину појединих бендова. Маркери протеина у боји разликују се различитим бојама, што је још препознатљивије. Штавише, ако се шалични маркарска маркер излази у тупи експеримент електрофорезе, расположење ће у овом тренутку бити срећније!
Поред горе наведеног, на тржишту постоје неке друге врсте протеинских маркера: флуоресцентни протеински маркери, биотинилирани маркери, развијени протеински маркери итд ....
Поред тога, маркери протеина су категорисани у велику молекулску тежину, малу молекуларну тежину и широку молекуларну тежину према молекуларном опсегу тежине. Помоћу високих молекуларних тежинских распона често се користе за велике молекуларне протеине масе, док се мале маркери молекуларне тежине често користе за мале протеине или чак неке пептиде. Ако размислите о целој лабораторији, изаберите широке молекуларне маркере са више униформних расподјела бенда, тако да се ваши протеини могу лако оценити без обзира на који интервал су унутра.
Неки проблеми са маркером
Да ли сви маркери морају да понестају?
На пример, упутство за употребу наводи 7 бендова, у ствари је нормално да искористите 6 бендова, то је да време трајања није довољно, ако ваш протеин није баш мали, можете да сачекате бромофенол плави фронт да пође из гела пре него што искључите апарат за електрофорезију, тако да бисте требали да имате 7 опсега. Понекад ће бити 5 бендова, али све док се дугачак и доњи два опсега вашег циљног протеина могу понестати, то не мора бити 7 опсега.
Шта да радим ако се маркер претвара у смајлично лице?
Прво, гел се не притисне
Друго, флуидност лепила на ивици плоче и средина лепила може бити другачија, не постоји начин да то учините, са вискозности и површинском напетошћу. Ако разне методе не могу да реше горњи феномен, произвођач личних савета да промени канал на узорку, изаберите траку у близини центра пливачке траке да бисте покренули трчање.
Ефекат ивице, на ивици две траке узорка биће овако. Можете испробати спорије брзине електрофорезе ......
Или је лепак није добро притиснут када је припремљен, лепак није добро припремљен или је напон електрофорезе превисок, електрична плоча је јака или стаклена плоча није добро причвршћена током електрофорезе и раствор електрофореза процури, и провјерите их један по један.
Како решити проблем проширења маркерских бендова?
Узрок 1: Запремина узорка је превише, запремина узорка треба смањити.
Противмера: Јачина узорка треба флексибилно да се контролише у складу са концентрацијом узорка и дебљине гела. Генерално, запремина узорка је 10-15 ул (тј. 2-10μг протеина). Ако је узорак врло разблажен, количина узорка може достићи 100 ул.
Узрок 2: Непотпуно растварање узорка.
Контрамерес:
(1) Узорак треба у потпуности распустити: Држите све врсте узорака протеина и маркера се могу у потпуности растворити пре узорковања, боље је центритирати узорак пре узорковања и уклонити честице које се не могу распустити.
(2) раствор растварања узорка може се додати у складу са захтевима протеинских комплета за стандарде молекуларних тежина; Ако су стандардни и непознати узорци самоконтролирани, следите 0,5-1,0 мг / л раствор растварања узорка. Након растварања, пренесите је на ЕП цев, ставите поклопац (можете да додате снимак на капу), а затим је загревати у воденој купељи на 110 степени Целзијуса на 3 минута (можете да изричете неколико округлог рупа са истим пречником, а Еп Еп Епрубе је ограничено да се ивица поклопце постаје све док се ивица капице постаје све док се ивица поклопце постаје све док се ивица поклопце постаје све док се ивица поклопца додатно одлаже. ЕП цеви, у кувању водене купељи и танка стиропорна плоча природно плови у куханој воденој купељи. Танки стиропорна лист природно лебди на површини кључале воде, што је лакше приступити и топлоти и избећи прскање кључале воде.
Група ЕП епрувета се може поставити у кухање воде за различито време. (Не бацајте еп епрувете у кухање воде за кухање, поклопци се могу исперити), а затим се хладити на собној температури за употребу. Ако се узорак не користи дуже време, сачувајте узорак у фрижидеру на -20 степени Целзијуса, а по потреби загрејте узорак у кипућој води на 110 степени Целзијуса на 3 минута на собној температури и охлади пре него што је уклони узорак и затим га уклони узорак и затим га примени узорак и притисните узорак и затим га примените узорак и затим га примјењивати узорак и затим га наносите узорак и затим га наносите узорак.
(3) Промените узорак пуфер решења како би се узорак у потпуности распустио и количина СДС-а треба да буде довољна.
Разлог: СДС бендови су електрофоретски повезани са суседним протеинима. Поред прекомерног узорковања и непотпуног растварања узорка, цурење узорка бунара гела може проузроковати проширење електрофоретских бендова. Пропуштање је често изазвано пукотинама између гела и стаклене плоче. Противмере: У овом тренутку гел се може поново припремити, чешаљ би требао бити опрезан приликом повлачења кохезије гела, брзина не би требало да буде пребрза, правац повлачења треба да буде окомит на површину гела; Да бисте избегли пукотине између стаклене плоче са обе стране гела и гела, не стисните стаклену плочу са обе стране гела у процесу припреме гела.
