Дефиниција и употреба протеинских маркера
Протеински маркер је мешавина протеина познате молекулске тежине, која се користи као „лењир“ за означавање величине протеинских трака.
У процесу Вестерн Блот-а, маркер молекулске тежине је као шраф, иако је то мала карика, међутим, то је тако мали детаљ који има значајан утицај на експерименталне резултате. Улога маркера се углавном користи да укаже на молекуларну тежину трака протеина која одговара величини молекулске тежине, и само ако стандардна количина тачне и тачне ознаке протеина такође показује да ли су резултати додавања тачних и тачних резултата експеримента такође да ли мембрана трансфицирана или не. Поред тога, такође показује да ли је мембрански трансфер успешан или не, као и степен електрофорезе протеина на гелу итд. Стога је избор правог протеинског маркера такође један од неопходних услова за успех Вестерн Блот експеримената.
Класификација протеинских маркера
Уопштено говорећи, најчешће коришћени протеински маркери су категорисани у не-пребојене протеинске маркере и претходно обојене протеинске маркере.
То је премикс неколико протеина познате молекулске тежине и пречишћени, што је погодно за поређење протеина различитих величина. Маркер који није претходно обојен није тако добар као претходно обојени маркер јер је потпуно невидљив током електрофорезе, и може се индицирати само након бојења протеина на крају електрофорезе, и не може се користити као референца у експерименталном процесу, који припада типу 'ретрофорезе'. Међутим, пошто протеин није праћен молекулом боје или молекулом маркера, приказана величина је тачно оригинална величина протеина, тако да је тачнија и може прецизно одредити величину протеина.
Пре-микед Маркер обично има неколико бендова који удвостручују концентрацију као индикацију, јер што је више бендова помешано, то је горе за памћење, ко зна који је тај! Тешко је избројати док вам се очи не замуте. Дакле, када видите оне посебно концентрисане, траке маркера ће запамтити где се налазе. Ипак, запамтите, мање траке обично није тако лако видети. У смислу селекције, наравно, најбоље је да изаберете бар једну од трака која је по величини слична вашем циљном протеину, што је ближе, то боље.
Претходно обојени протеински маркер су неки пречишћени протеини помешани заједно ковалентним спајањем са бојом, што се може директно посматрати током електрофорезе или мембранског трансфера.
Претходно обојени протеински маркери су погодни за наше експерименте. Овај стандард за молекуларну тежину протеина може нам помоћи да пратимо електрофорезу и проценимо покретљивост током и после електрофорезе, као и након трансфера мембране – на пример, ако се зна да је оптимална зона резолуције за вертикалну електрофорезу око 2/3 пута кроз гел, коришћењем претходно обојеног маркера могуће је да На пример, познато је да је оптимална резолуција око електрофорезе/гела око 2/3 гела. ако користите унапред обојени маркер, можете предвидети када циљни протеин уђе у зону оптималне резолуције и зауставити електрофорезу да бисте добили ефекат оптималне резолуције; такође можете на време прекинути електрофорезу ако приметите абнормалност у електрофорези маркера; поред тога, можете посматрати да ли се протеин у потпуности преноси на мембрану након преноса мембране у Вестерн Блоту и можете означити молекуларну тежину протеина на мембрани, због чега привлачи многе лабораторије да купе унапред обојени стандард протеина.
Вреди напоменути да је претходно обојени протеински маркер ковалентно упарен са бојом, тако да се карактеристике миграције могу променити када се електрофорезе под различитим условима пуфера, што може довести до неких одступања, тако да није погодан за прецизну локализацију протеина - међутим, у већини случајева, траке на маркеру можда нису идентичне са циљаним протеином, а резултати су само исти, а резултати су исти. Међутим, у већини случајева, траке маркера можда нису потпуно исте као наш циљни протеин, а оно што добијамо је само референтна величина у односу на индикацију маркера, и на крају, требамо Вестерн да је окарактеришемо, тако да ако не треба да правимо разлику између трака сличних величина, претходно обојени маркер је и даље веома користан, а такође се може користити у комбинацији са стандардним протеином у унс.
Класификација претходно обојених протеинских маркера
Претходно обојени протеински маркер се дели на: једнобојни претходно обојени и вишебојни претходно обојени, једнобојни претходно обојени протеински маркер обично користи неке од трака да удвостручи концентрацију одређених трака како би продубио дебљину одређених трака да би сугерисао величину њихове величине, тако да можемо брзо да запамтимо и разликујемо величину појединачних трака. Протеински маркери у боји се разликују по различитим бојама, што је још препознатљивије. Штавише, ако се шарени дугин маркер појави у досадном експерименту електрофорезе, расположење ће у овом тренутку бити срећније!
Поред наведених, на тржишту постоје још неке врсте протеинских маркера: флуоресцентни протеински маркери, биотиниловани маркери, развијени протеински маркери, итд.
Поред тога, протеински маркери су категорисани на високу молекуларну тежину, малу молекулску тежину и широку молекулску тежину према опсегу молекуларне тежине. Маркери опсега високе молекулске тежине се често користе за протеине велике молекуларне тежине, док се маркери опсега мале молекулске тежине често користе за мале протеине или чак неке пептиде. ако узмете у обзир целу лабораторију, изаберите маркере широке молекулске тежине са равномернијом дистрибуцијом трака, тако да се ваши протеини могу лако проценити без обзира у ком интервалу се налазе.
Неки проблеми са маркером
На пример, упутство за употребу наводи 7 трака, у ствари, нормално је да понестане 6 трака, може бити да време рада није довољно, ако ваш протеин није јако мали, можете сачекати да бромофенол плави фронт истекне из гела пре него што искључите апарат за електрофорезу, тако да бисте могли да имате 7 трака. Понекад ће бити 5 трака, али све док горње и доње две траке вашег циљног протеина могу да понестане, то не мора бити 7 трака.
Прво, гел није притиснут
Друго, флуидност лепка на ивици плоче и центру лепка може бити различита, не постоји начин да се то уради, са вискозитетом и површинским напоном. Ако различите методе не могу да реше горе наведени феномен, лични саветник да промените канал на узорку, изаберите траку близу центра пливачке траке за трчање.
Ефекат ивице, на ивици две траке узорка ће бити овакав. Можете пробати спорију брзину електрофорезе ......
Или лепак није добро притиснут када је припремљен, лепак није добро припремљен, или је напон електрофорезе превисок, електроосмотска сила је јака, или стаклена плоча није добро стегнута током електрофорезе, а унутрашњи раствор за електрофорезу цури, проверите их један по један.
Узрок 1: Запремина узорка је превелика, запремину узорка треба смањити.
Противмера: Запремину узорка треба флексибилно контролисати у складу са концентрацијом узорка и дебљином гела. Генерално, запремина узорка је 10-15 μЛ (тј. 2-10 μг протеина). Ако је узорак веома разблажен, запремина узорка може да достигне 100 μЛ.
Узрок 2: Непотпуно растварање узорка.
Противмере:
(1) Узорак треба да буде потпуно растворен: чувајте све врсте узорака протеина и маркер се може потпуно растворити пре узорковања, боље је центрифугирати узорак пре узорковања и уклонити честице које се не могу растворити.
(2) Раствор за растварање узорка се може додати у складу са захтевима протеинских комплета за стандарде молекулске тежине; ако се стандардни и непознати узорци сами конфигуришу, следите раствор раствора узорка од 0,5-1,0 мг/Л. Након растварања, пребаците га у Еп цев, ставите поклопац (можете да додате штипаљку на чеп) и затим га загрејте у воденом купатилу на 110 степени Целзијуса 3 минута (можете избушити неколико округлих рупа истог пречника као Еп цев у танкој плочи од стиропора, а Еп цев се спушта доле, а затим се ивица танке капице не спусти и даље не навуче ивицу капице. Плоча од стиропора, која излаже већи део тела Еп цеви, у купатилу са кључањем, а танка плоча од стиропора природно плута у купатилу са кључалом водом.
Серија Еп епрувета може се ставити у кључало водено купатило на различито време. (Не бацајте Еп епрувете у кључало водено купатило, поклопци се могу испрати) и затим охладите на собној температури за употребу. Ако се узорак не користи дуже време, узорак чувајте у фрижидеру на -20 степени Целзијуса, а по потреби загрејте узорак у кључалој води на 110 степени Целзијуса у трајању од 3 минута на собној температури и охладите га пре него што га уклоните за употребу и затим примените узорак да бисте уклонили подстабилне агрегате у протеинима узорка.
(3) Промените раствор пуфера за узорке тако да узорак може бити потпуно растворен и да количина СДС буде довољна.
Разлог: СДС траке су електрофоретски повезане са суседним протеинима. Поред прекомерног узорковања и непотпуног растварања узорка, цурење из отвора за узорке гела може изазвати ширење електрофоретских трака. Цурење је често узроковано пукотинама између гела и стаклене плоче. Противмере: У овом тренутку, гел се може само поново припремити, чешаљ треба да буде опрезан када је повлачење гела завршено, брзина не би требало да буде пребрза, смер повлачења треба да буде окомит на површину гела; да бисте избегли пукотине између стаклене плоче са обе стране гела и гела, немојте стискати стаклену плочу са обе стране гела у процесу припреме гела.
