Definitie en gebruik van eiwitmarkers
Protein Marker is een mengsel van eiwitten met een bekend molecuulgewicht, dat wordt gebruikt als 'liniaal' om de grootte van eiwitbanden aan te geven.
In het proces van Western Blot is de molecuulgewichtsmarker als een schroef, hoewel het een kleine schakel is, maar het is zo'n klein detail dat een significant effect heeft op de experimentele resultaten. De rol van de marker wordt voornamelijk gebruikt om het molecuulgewicht van de eiwitbanden aan te geven, overeenkomend met de grootte van het molecuulgewicht, en alleen als de standaardhoeveelheid nauwkeurig en correct is, zijn de resultaten van de experimenten overtuigend. Daarnaast laat Protein Marker ook zien of het membraan is getransfecteerd of niet. Bovendien laat het ook zien of de membraanoverdracht succesvol is of niet, de mate van elektroforese van het eiwit op de gel, enz. Daarom is het kiezen van de juiste eiwitmarker ook een van de noodzakelijke voorwaarden voor het succes van Western Blot-experimenten.
Classificatie van eiwitmarkers
Over het algemeen worden de meest gebruikte eiwitmarkers onderverdeeld in niet-voorgekleurde eiwitmarkers en voorgekleurde eiwitmarkers.
Het is een premix van verschillende eiwitten met een bekend molecuulgewicht en gezuiverd, wat handig is voor de vergelijking van eiwitten van verschillende groottes. Niet-voorgekleurde Marker is niet zo goed als voorgekleurde Marker omdat deze volledig onzichtbaar is tijdens elektroforese, en alleen kan worden aangegeven na eiwitkleuring aan het einde van de elektroforese, en niet kan worden gebruikt als referentie in het experimentele proces, dat behoort tot het type 'achteraf'. Omdat het eiwit echter niet vergezeld gaat van een kleurstofmolecuul of een markermolecuul, is de weergegeven grootte precies de oorspronkelijke grootte van het eiwit, zodat deze nauwkeuriger is en de grootte van het eiwit nauwkeurig kan bepalen.
Voorgemixte Marker heeft meestal een paar bands die de concentratie verdubbelen als indicatie, want hoe meer bands er gemixt worden, hoe slechter het is om te onthouden, wie weet welke dat is! Het is moeilijk om te tellen totdat je ogen wazig zijn. Dus als je de bijzonder geconcentreerde ziet, zullen de markeringsbanden onthouden waar ze zijn. Houd er echter rekening mee dat de kleinere banden meestal niet zo gemakkelijk te zien zijn. Wat de selectie betreft, is het natuurlijk het beste om ten minste één van de banden te kiezen die qua grootte vergelijkbaar is met uw doeleiwit, hoe dichterbij hoe beter.
Voorgekleurde Protein Marker bestaat uit enkele gezuiverde eiwitten die met elkaar zijn gemengd door covalente koppeling met een kleurstof, die direct kan worden waargenomen tijdens elektroforese of membraanoverdracht.
Voorgekleurde eiwitmarkers zijn handig voor onze experimenten. Deze standaard voor het molecuulgewicht van eiwitten kan ons helpen bij het monitoren van elektroforese en het inschatten van de mobiliteit tijdens en na elektroforese, evenals na membraanoverdracht. Als bijvoorbeeld bekend is dat de optimale resolutiezone voor verticale elektroforese ongeveer 2/3 van de weg door de gel bedraagt, is het met behulp van een voorgekleurde marker mogelijk om. Het is bijvoorbeeld bekend dat de optimale resolutiezone van verticale elektroforese ongeveer 2/3 van de gel bedraagt. Als u een voorgekleurde marker gebruikt, kunt u voorspellen wanneer het doeleiwit komt de optimale resolutiezone binnen en stopt de elektroforese om het optimale resolutie-effect te verkrijgen; u kunt de elektroforese ook tijdig beëindigen als u een afwijking constateert in de elektroforese van de Marker; Bovendien kun je zien of het eiwit volledig naar het membraan wordt overgebracht na de overdracht van het membraan in de Western Blot en kun je het molecuulgewicht van het eiwit op het membraan labelen. Daarom trekt het veel laboratoria aan om de voorgekleurde eiwitstandaard te kopen.
Het is vermeldenswaard dat de voorgekleurde eiwitmarker covalent is gekoppeld aan de kleurstof, zodat de migratiekarakteristieken kunnen veranderen bij elektroforese onder verschillende bufferomstandigheden, wat tot enkele afwijkingen kan leiden. Het is dus niet geschikt voor nauwkeurige lokalisatie van eiwitten. In de meeste gevallen zijn de banden op de marker echter mogelijk niet identiek aan het doeleiwit en zijn de resultaten die we krijgen precies hetzelfde als die van het doeleiwit. In de meeste gevallen zijn de Marker-banden echter mogelijk niet precies hetzelfde als ons doeleiwit, en wat we krijgen is slechts een referentiegrootte ten opzichte van de Marker-indicatie, en uiteindelijk hebben we Western nodig om deze te karakteriseren, dus als we geen onderscheid hoeven te maken tussen banden van vergelijkbare grootte, is de voorgekleurde Marker nog steeds erg nuttig, en deze kan ook worden gebruikt in combinatie met de ongekleurde eiwitstandaard.
Classificatie van voorgekleurde eiwitmarkers
Voorgekleurde eiwitmarker is onderverdeeld in: monochrome voorgekleurde en meerkleurige voorgekleurde, monochrome voorgekleurde eiwitmarker gebruikt meestal enkele banden om de concentratie van bepaalde banden te verdubbelen om de dikte van bepaalde banden te verdiepen om de grootte van hun grootte te suggereren, zodat we de grootte van de individuele banden snel kunnen onthouden en onderscheiden. Kleureiwitmarkers onderscheiden zich door verschillende kleuren, wat nog herkenbaarder is. Bovendien, als een kleurrijke regenboogmarkering tevoorschijn komt in een saai elektroforese-experiment, zal de stemming op dit moment gelukkiger zijn!
Naast het bovenstaande zijn er nog enkele andere soorten eiwitmarkers op de markt: fluorescerende eiwitmarkers, gebiotinyleerde markers, ontwikkelde eiwitmarkers, enz....
Bovendien worden eiwitmarkers onderverdeeld in hoog molecuulgewicht, laag molecuulgewicht en breed molecuulgewicht, afhankelijk van het molecuulgewichtsbereik. Markers met een hoog molecuulgewicht worden vaak gebruikt voor eiwitten met een hoog molecuulgewicht, terwijl markers met een klein molecuulgewicht vaak worden gebruikt voor kleine eiwitten of zelfs voor sommige peptiden. Als u het hele laboratorium in ogenschouw neemt, kies dan voor markers met een breed molecuulgewicht en een meer uniforme bandverdeling, zodat uw eiwitten gemakkelijk kunnen worden beoordeeld, ongeacht in welk interval ze zich bevinden.
Enkele problemen met Marker
De gebruiksaanwijzing vermeldt bijvoorbeeld 7 banden. Het is zelfs normaal dat er 6 banden op zijn. Het kan zijn dat de looptijd niet voldoende is. Als uw eiwit niet erg klein is, kunt u wachten tot het broomfenolblauwe front uit de gel loopt voordat u het elektroforeseapparaat uitschakelt, zodat u over 7 banden zou moeten kunnen beschikken. Soms zijn er vijf banden, maar zolang de bovenste en onderste twee banden van uw doeleiwit opgebruikt kunnen worden, hoeven het geen zeven banden te zijn.
Ten eerste wordt de gel niet geperst
Ten tweede kan de vloeibaarheid van de lijm aan de rand van de plaat en het midden van de lijm verschillend zijn, dit kan niet worden gedaan vanwege de viscositeit en oppervlaktespanning. Als een verscheidenheid aan methoden het bovenstaande fenomeen niet kan oplossen, kan een persoonlijk adviesmaker om een kanaal op het monster te veranderen, een baan kiezen nabij het midden van de zwembaan om te rennen.
Het randeffect aan de rand van de twee rijstroken van het monster zal er als volgt uitzien. Je kunt een lagere elektroforesesnelheid proberen......
Ofwel is de lijm niet goed aangedrukt wanneer deze wordt voorbereid, is de lijm niet goed voorbereid, of is de elektroforesespanning te hoog, is de elektro-osmotische kracht sterk, of is de glasplaat tijdens de elektroforese niet goed vastgeklemd en lekt de interne elektroforese-oplossing. Controleer ze één voor één.
Oorzaak 1: Het monstervolume is te groot, het monstervolume moet worden verkleind.
Tegenmaatregel: Het monstervolume moet flexibel worden geregeld op basis van de monsterconcentratie en de geldikte. Over het algemeen bedraagt het monstervolume 10-15 μl (dwz 2-10 μg eiwit). Als het monster erg verdund is, kan het monstervolume 100 μl bereiken.
Oorzaak 2: Onvolledige oplossing van het monster.
Tegenmaatregelen:
(1) Het monster moet volledig worden opgelost: bewaar alle soorten eiwitmonsters en Marker kan volledig worden opgelost vóór de bemonstering. Het is beter om het monster vóór de bemonstering te centrifugeren en de deeltjes te verwijderen die niet kunnen worden opgelost.
(2) Monsteroplossingsoplossing kan worden toegevoegd volgens de vereisten van eiwitkits voor molecuulgewichtstandaarden; als de standaard- en onbekende monsters zelf worden geconfigureerd, volg dan de oplossing voor monsteroplossing van 0,5-1,0 mg/l. Breng het na oplossing over naar de Ep-buis, plaats de dop erop (je kunt een clip aan de dop toevoegen) en verwarm het vervolgens in een waterbad van 110 graden Celsius gedurende 3 minuten (je kunt verschillende ronde gaten boren met dezelfde diameter als de Ep-buis in de dunne piepschuimplaat, en de Ep-buis wordt neergezet totdat de rand van de dop niet verder naar beneden kan gaan, en plaats dan de dunne piepschuimplaat, die het grootste deel van het lichaam blootlegt. de Ep-buis, in het kokendwaterbad, en de dunne piepschuimplaat drijft op natuurlijke wijze in het kokende waterbad. Het dunne piepschuimvel drijft op natuurlijke wijze op het oppervlak van het kokende water, waardoor het gemakkelijker toegankelijk is en wordt verwarmd, en spatten van het kokende water wordt vermeden.
Een batch Ep-buizen kan voor verschillende tijdstippen in het kokendwaterbad worden geplaatst. (Gooi de Ep-buizen niet in het kokendwaterbad, de deksels kunnen worden afgewassen) en koel ze vervolgens af tot kamertemperatuur voor gebruik. Als het monster langere tijd niet wordt gebruikt, bewaar het monster dan in een koelkast bij -20 graden Celsius en verwarm het monster indien nodig gedurende 3 minuten in kokend water van 110 graden Celsius bij kamertemperatuur en koel het af voordat u het voor gebruik verwijdert en vervolgens het monster aanbrengt om de substabiele aggregaten in de monstereiwitten te verwijderen.
(3) Verander de monsterbufferoplossing zodat het monster volledig kan worden opgelost en de hoeveelheid SDS voldoende moet zijn.
Reden: SDS-banden zijn elektroforetisch gekoppeld aan naburige eiwitten. Naast overbemonstering en onvolledige oplossing van het monster, kan lekkage van de monsterputjes van de gel ervoor zorgen dat de elektroforetische banden breder worden. De lekkage wordt vaak veroorzaakt door scheuren tussen de gel en de glasplaat. Tegenmaatregelen: Op dit moment kan de gel alleen opnieuw worden voorbereid, de kam moet voorzichtig zijn bij het omhoog trekken van de gelcohesie is voltooid, de snelheid mag niet te hoog zijn, de richting van het omhoog trekken moet loodrecht op het oppervlak van de gel staan; Om scheuren tussen de glasplaat aan beide zijden van de gel en de gel te voorkomen, mag u tijdens het gelbereidingsproces niet in de glasplaat aan beide zijden van de gel knijpen.
