Definitie en gebruik van eiwitmarkering
Eiwitmarker is een mengsel van eiwitten met een bekend molecuulgewicht, dat wordt gebruikt als een 'liniaal ' om de grootte van eiwitbanden aan te geven.
In het proces van Western -blot is de marker van het molecuulgewicht als een schroef, hoewel het een kleine schakel is, is het echter zo'n klein detail dat een significant effect heeft op de experimentele resultaten. De rol van de marker wordt voornamelijk gebruikt om aan te geven Membraan is getransfecteerd of niet. Bovendien laat het ook zien of de membraanoverdracht succesvol is of niet, en de mate van elektroforese van het eiwit op de gel, enz. Daarom is het kiezen van de juiste eiwitmarker ook een van de noodzakelijke voorwaarden voor het succes van Western -blot -experimenten.
Classificatie van eiwitmarkers
Over het algemeen zijn de meest gebruikte eiwitmarkers gecategoriseerd in niet-gekleurde eiwitmarkers en vooraf bevlekte eiwitmarkers.
Het is een premix van verschillende eiwitten met een bekend molecuulgewicht en gezuiverd, wat handig is voor de vergelijking van eiwitten van verschillende grootte. Niet-pre-gekleurde marker is niet zo goed als vooraf bevlekte marker omdat het volledig onzichtbaar is tijdens elektroforese en alleen kan worden aangegeven na eiwitkleuring aan het einde van de elektroforese, en kan niet worden gebruikt als een referentie in het experimentele proces, dat behoort tot het type 'achteraf gezien '. Omdat het eiwit echter niet gepaard gaat met een kleurstofmolecuul of een markermolecuul, is de getoonde grootte precies de oorspronkelijke grootte van het eiwit, dus het is nauwkeuriger en kan de grootte van het eiwit nauwkeurig bepalen.
Voorgemengde marker heeft meestal een paar banden die de concentratie als een indicatie verdubbelen, omdat hoe meer banden gemengd zijn, hoe erger het is om te onthouden, wie weet welke die is! Het is moeilijk om te tellen totdat je ogen wazig zijn. Dus als je de bijzonder geconcentreerde ziet, zullen de markerbanden onthouden waar ze zijn. Vergeet echter niet dat de kleinere banden meestal niet zo gemakkelijk te zien zijn. Qua selectie is het natuurlijk het beste om ten minste een van de banden te kiezen die qua grootte vergelijkbaar is met je doeleiwit, hoe beter.
Pre-gekleurde eiwitmarker is enkele gezuiverde eiwitten gemengd door covalente koppeling met een kleurstof, die direct kan worden waargenomen tijdens elektroforese of membraanoverdracht.
Voorgevormde eiwitmarkers zijn handig voor onze experimenten. Deze standaard van eiwitmolecuulgewicht kan ons helpen de elektroforese te volgen en de mobiliteit te schatten tijdens en na elektroforese, evenals na membraanoverdracht - bijvoorbeeld, als bekend is dat het de optimale elektroforese is van de optroforische elektroforese is ongeveer 2/3 van de gel. Als u een vooraf bevlekte marker gebruikt, kunt u voorspellen wanneer het doel-eiwit de optimale resolutiezone binnengaat en de elektroforese stoppen om het optimale resolutie-effect te krijgen; U kunt ook de elektroforese in de tijd beëindigen als u een afwijking in de elektroforese van de marker waarneemt; Bovendien kunt u observeren of het eiwit volledig naar het membraan wordt overgebracht na de overdracht van membraan in de Western-blot en u kunt het molecuulgewicht van het eiwit op het membraan labelen, daarom trekt het veel laboratoria aan om de vooraf bevlekte eiwitstandaard te kopen.
Het is vermeldenswaard dat de vooraf bevlekte eiwitmarker covalent is gekoppeld aan de kleurstof, dus de migratiekarakteristieken kunnen veranderen wanneer geëlektroforeerd onder verschillende bufferomstandigheden, wat kan leiden tot sommige afwijkingen, dus het is niet geschikt voor precieze lokalisatie van eiwitten - echter, in de meeste gevallen, zijn de bands op de marker mogelijk niet identiek aan het doelwit, en de resultaten zijn slechts hetzelfde als de doelwit. In de meeste gevallen zijn de markerbanden echter mogelijk niet exact hetzelfde als ons doel-eiwit, en wat we krijgen is slechts een referentiegrootte ten opzichte van de markerindicatie, en uiteindelijk hebben we Western nodig om het te karakteriseren, dus als we geen onderscheid hoeven te maken tussen banden van vergelijkbare grootte, is de voorgekleurde marker nog steeds zeer nuttig en kan het ook worden gebruikt in compunctie met de niet-vastgestelde eiwitstandaard.
Classificatie van de prested eiwitmarker
Pre-gekleurde eiwitmarker is verdeeld in: monochrome voorgekleurd en meerkleurige vooraf bevlekte, monochrome vooraf bevlekte eiwitmarker zal meestal sommige van de banden gebruiken om de concentratie van bepaalde banden te verdubbelen om de dikte van bepaalde banden te verdiepen om de grootte van hun grootte te suggereren, zodat we snel kunnen onthouden tussen de grootte van de individuele bands. Kleureiwitmarkers onderscheiden zich door verschillende kleuren, wat nog meer herkenbaar is. Bovendien, als een kleurrijke regenboogmarker uitkomt in een saai elektroforese -experiment, zal de stemming op dit moment gelukkiger zijn!
Naast het bovenstaande zijn er enkele andere soorten eiwitmarkers op de markt: fluorescerende eiwitmarkers, gebiotinyleerde markers, ontwikkelde eiwitmarkers, enz ...
Bovendien worden eiwitmarkers gecategoriseerd in hoog molecuulgewicht, laag molecuulgewicht en breed molecuulgewicht volgens molecuulgewichtbereik. Markers met een hoog molecuulgewicht worden vaak gebruikt voor grote molecuulgewichteiwitten, terwijl kleine molecuulgewichtsbereikingsmarkers vaak worden gebruikt voor kleine eiwitten of zelfs sommige peptiden. Als u het hele laboratorium overweegt, kiest u voor brede molecuulgewichtsmarkers met meer uniforme bandverdeling, zodat uw eiwitten gemakkelijk kunnen worden beoordeeld, ongeacht het interval dat ze bevinden.
Enkele problemen met marker
In de instructiehandleiding staat bijvoorbeeld 7 banden, het is in feite normaal om 6 banden te belopen, het kan zijn dat de looptijd niet genoeg is, als je eiwit niet erg klein is, kun je wachten tot het bromofenolblauwe front uit de gel is voordat je het elektroforese -apparaat uitschakelt, zodat je 7 bands zou moeten hebben. Soms zullen er 5 banden zijn, maar zolang de bovenste en onderste twee banden van je doel -eiwit kunnen worden opgeraakt, hoeft het geen 7 banden te zijn.
Ten eerste wordt de gel niet ingedrukt
Ten tweede kan de vloeibaarheid van de lijm aan de rand van de plaat en het midden van de lijm anders zijn, er is geen manier om dit te doen, met de viscositeit en oppervlaktespanning. Als een verscheidenheid aan methoden het bovenstaande fenomeen niet kan oplossen, kiest Personal Advice Maker om een kanaal op de steekproef te wijzigen, een rijstrook in de buurt van het midden van de zwembaan om een run te lopen.
Randeffect, aan de rand van de twee rijstroken van het monster zal zo zijn. Je kunt een langzamere elektroforese snelheid proberen ......
Ofwel de lijm wordt niet goed geperst wanneer deze wordt bereid, de lijm is niet goed voorbereid, of de elektroforese -spanning is te hoog, de elektrosmotische kracht is sterk, of de glazen plaat is niet goed geklemd tijdens elektroforese en de binnenste elektroforese -oplossing lekt, controleer ze alsjeblieft één voor één.
Oorzaak 1: Het monstervolume is te veel, het monstervolume moet worden verminderd.
Tegenmaatregel: het monstervolume moet flexibel worden geregeld volgens de monsterconcentratie en geldikte. Over het algemeen is het monstervolume 10-15 ul (dwz 2-10μg eiwit). Als het monster erg verdund is, kan het monstervolume 100 ul bereiken.
Oorzaak 2: onvolledige oplossing van het monster.
Tegenmaatregelen:
(1) Het monster moet volledig worden opgelost: behouden alle soorten eiwitmonsters en marker kan volledig worden opgelost vóór bemonstering, het is beter om het monster te centrifugeren vóór bemonstering en de deeltjes te verwijderen die niet kunnen worden opgelost.
(2) oplossing voor het oplossen van monsters kan worden toegevoegd volgens de vereisten van eiwitkits voor normen voor molecuulgewicht; Als de standaard en onbekende monsters zelf worden geconfigureerd, volgt u de oplossing van 0,5-1,0 mg/L monsteroplossing. Breng het na het oplossen over naar EP -buis, leg de dop op (je kunt een clip aan de dop toevoegen) en verwarm deze vervolgens in een waterbad op 110 graden Celsius gedurende 3 minuten (je kunt verschillende ronde gaten boren met dezelfde diameter met dezelfde diameter als de EP -buis in de dunne steyfoam -plaat, die de dunne dunne -dun een dunne -dunne -dunne -dunne -dunne -dunne is, die het beste van de dunne paal is, die het beste is Lichaam van de EP -buis, in het kokende waterbad, en de dunne piepschuimplaat zweeft van nature in het kookwaterbad.
Een batch EP -buizen kan voor verschillende tijden in het kokende waterbad worden geplaatst. (Gooi de EP -buizen niet in het kookwaterbad, de deksels kunnen worden afgewassen) en koelen vervolgens bij kamertemperatuur voor gebruik. Als het monster niet gedurende een langere periode wordt gebruikt, bewaar het monster in een koelkast bij -20 graden Celsius en verwarm het monster wanneer dat nodig is, gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur bij kamertemperatuur in het kookwater op 110 graden Celsius en koel het voordat het wordt verwijderd voor gebruik en breng het monster aan om de substabele aggregaten in de steekproefproteïnen te verwijderen.
(3) Verander de monsterbufferoplossing zodat het monster volledig kan worden opgelost en de hoeveelheid SDS voldoende moet zijn.
Reden: SDS -banden zijn elektroforetisch gekoppeld aan aangrenzende eiwitten. Naast overbemonstering en onvolledige oplossing van het monster, kan lekkage van de monsterputten van de gel ertoe leiden dat de elektroforetische banden zich verbreden. De lekkage wordt vaak veroorzaakt door scheuren tussen de gel en de glazen plaat. Tegenmaatregelen: op dit moment kan de gel alleen opnieuw worden voorbereid, de kam moet voorzichtig zijn bij het opheffen van de gelcohesie is voltooid, de snelheid moet niet te snel zijn, de richting van het optrekken moet loodrecht op het oppervlak van de gel staan; Om scheuren tussen de glazen plaat aan beide zijden van de gel en de gel te voorkomen, knijp de glazen plaat niet aan beide zijden van de gel in het proces van gelbereiding.
