Definizione e utilizzo del marcatore proteico
Il marcatore proteico è una miscela di proteine di peso molecolare noto, che viene utilizzato come 'righello ' per indicare la dimensione delle bande proteiche.
Nel processo di Western blot, il marcatore di peso molecolare è come una vite, sebbene sia un piccolo collegamento, tuttavia, è un dettaglio così piccolo che ha un effetto significativo sui risultati sperimentali. La membrana è trasfettata o meno. Inoltre, mostra anche se il trasferimento della membrana ha successo o meno e il grado di elettroforesi della proteina sul gel, ecc. Pertanto, la scelta del marcatore proteico giusto è anche una delle condizioni necessarie per il successo degli esperimenti Western Blot.
Classificazione dei marcatori proteici
In generale, i marcatori proteici più comunemente usati sono classificati in marcatori proteici non colorati e marcatori proteici pre-macchiati.
È una premix di diverse proteine di peso molecolare noto e purificato, che è conveniente per il confronto di proteine di dimensioni diverse. Il marcatore non colorato non è buono come il marcatore pre-macchiato perché è completamente invisibile durante l'elettroforesi e può essere indicato solo dopo la colorazione proteica alla fine dell'elettroforesi e non può essere usato come riferimento nel processo sperimentale, che appartiene al tipo di 'posteriore '. Tuttavia, poiché la proteina non è accompagnata da una molecola di colorante o da una molecola marker, la dimensione mostrata è esattamente la dimensione originale della proteina, quindi è più accurata e può determinare accuratamente la dimensione della proteina.
Il marcatore pre-miscelato di solito ha alcune bande che raddoppiano la concentrazione come indicazione, perché più bande sono mescolate, peggio è da ricordare, chissà quale è quello! È difficile contare fino a quando i tuoi occhi non sono sfocati. Quindi, quando vedi quelli particolarmente concentrati, le bande marker ricorderanno dove sono. Ricorda però, le bande più piccole di solito non sono così facili da vedere. In termini di selezione, ovviamente, è meglio scegliere almeno una delle bande di dimensioni simili alla proteina target, più è più vicino.
Il marcatore proteico pre-macchiato è alcune proteine purificate mescolate insieme dall'accoppiamento covalente con un colorante, che può essere osservata direttamente durante l'elettroforesi o il trasferimento di membrana.
I marcatori proteici pre-macchiati sono convenienti per i nostri esperimenti. Questo standard di peso molecolare proteico può aiutarci a monitorare l'elettroforesi e stimare la mobilità durante e dopo l'elettroforesi, nonché dopo il trasferimento di membrana - ad esempio, se è noto che la zona ottimale di risoluzione per l'elettroforesi verticale è circa 2/3 del gel, usando il marcatore pre -macchiato, è possibile ad esempio la resistenza ottimale della zone di verticale del Gel, usando il Gel pre -colorato, utilizzando il Gel pre -colorato, usando il Gel per il gel, usando il marcatore pre -macchiato, è possibile che la zone di verticale è per il gel, usando il marcatore pre -macchiato, è possibile che la zone ottimali è la zona di Vertica del Gel, usando il marcatore pre -macchiato, è possibile che la zone di verticale è per il gel, usando il marcatore pre -macchiato, è possibile per esempio la zone di verticale del Gel, usando il marcatore pre -macchiato, è possibile che la zone di verticale è per il Gel, usando il marcatore pre -macchtivamente Se si utilizza un marcatore pre-macchiato, è possibile prevedere quando la proteina target entra nella zona di risoluzione ottimale e interrompere l'elettroforesi per ottenere l'effetto di risoluzione ottimale; Puoi anche interrompere l'elettroforesi in tempo se si osserva un'anomalia nell'elettroforesi del marcatore; Inoltre, è possibile osservare se la proteina viene trasferita completamente sulla membrana dopo il trasferimento di membrana nella macchia occidentale e puoi etichettare il peso molecolare della proteina sulla membrana, motivo per cui attira molti laboratori per acquistare lo standard proteico pre-macchiato.
Vale la pena notare che il marcatore proteico pre -macchiato è accoppiato in modo covalente con il colorante, quindi le caratteristiche di migrazione possono cambiare quando elettroforizzate in diverse condizioni di tampone, il che può portare ad alcune deviazioni, quindi non è adatto per la localizzazione precisa delle proteine - per quanto, nella maggior parte dei casi, le bande sul marcatore non possono essere identiche al target proteina e i risultati sono solo il bersaglio. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, le bande di marker potrebbero non essere esattamente le stesse della nostra proteina target e ciò che otteniamo è solo una dimensione di riferimento rispetto all'indicazione del marcatore e, alla fine, abbiamo bisogno di Western per caratterizzarla, quindi se non abbiamo bisogno di distinguere tra bande di dimensioni simili, il marcatore pre-macchiato è ancora molto utile e può anche essere usato insieme a una standard di proteina non nota.
Classificazione del marcatore proteico prestato
Il marcatore proteico pre-macchiato è diviso in: marcatore proteico pre-macchiato monocromatico pre-colorato e multicolore, il marcatore proteico pre-macchiato di solito userà alcune bande per raddoppiare la concentrazione di alcune bande per approfondire lo spessore di alcune bande per suggerire le dimensioni delle loro dimensioni, in modo da poter memorizzare rapidamente e differenziare tra le dimensioni delle bande individuali. I marcatori delle proteine del colore si distinguono per colori diversi, il che è ancora più riconoscibile. Inoltre, se un indicatore arcobaleno colorato esce in un esperimento di elettroforesi opaca, l'umore sarà più felice in questo momento!
Oltre a quanto sopra, ci sono altri tipi di marcatori proteici sul mercato: marcatori di proteine fluorescenti, marcatori biotinilati, marcatori proteici sviluppati, ecc ....
Inoltre, i marcatori proteici sono classificati in peso molecolare elevato, basso peso molecolare e peso molecolare ampio in base alla gamma di peso molecolare. I marcatori ad alto peso molecolare sono spesso usati per le proteine di peso molecolare di grandi dimensioni, mentre i marcatori di intervalli di peso molecolare sono spesso usati per piccole proteine o persino alcuni peptidi. Se si considera l'intero laboratorio, scegli marcatori di peso molecolare ampi con una distribuzione di banda più uniforme, in modo che le tue proteine possano essere facilmente giudicate, indipendentemente dall'intervallo in cui si trovano.
Alcuni problemi con il marcatore
Ad esempio, il manuale di istruzioni elenca 7 bande, in effetti, è normale esaurire 6 bande, può darsi che il tempo di esecuzione non sia sufficiente, se la tua proteina non è molto piccola, puoi aspettare che il fronte blu bromofenolo finisca dal gel prima di spegnere l'apparato dell'elettroforesi, quindi dovresti avere 7 bande. A volte ci saranno 5 bande, ma finché le due bande superiori e inferiori della proteina target possono essere esaurite, non deve essere 7 bande.
Innanzitutto, il gel non viene premuto
In secondo luogo, la fluidità della colla sul bordo della piastra e il centro della colla può essere diversa, non c'è modo di farlo, con la viscosità e la tensione superficiale. Se una varietà di metodi non è possibile risolvere il fenomeno sopra, il produttore di consigli personali per cambiare un canale sul campione, scegli una corsia vicino al centro della corsia di nuoto per correre.
Effetto Edge, ai margini delle due corsie del campione sarà così. Puoi provare una velocità di elettroforesi più lenta ...
O la colla non è ben pressata quando è preparata, la colla non è ben preparata o la tensione di elettroforesi è troppo alta, la forza elettroosmotica è forte o la lastra di vetro non è ben bloccata durante l'elettroforesi e la soluzione di elettroforesi interna è che perde, per favore controllali uno per uno.
Causa 1: il volume del campione è troppo, il volume del campione dovrebbe essere ridotto.
Contromisura: il volume del campione deve essere controllato in modo flessibile in base alla concentrazione del campione e allo spessore del gel. Generalmente, il volume del campione è 10-15μL (cioè 2-10μg di proteina). Se il campione è molto diluito, il volume del campione può raggiungere 100 μL.
Causa 2: dissoluzione incompleta del campione.
Contromisure:
(1) Il campione deve essere completamente sciolto: mantenere tutti i tipi di campioni di proteine e il marcatore possono essere completamente sciolti prima del campionamento, è meglio centrifugare il campione prima del campionamento e rimuovere le particelle che non possono essere sciolte.
(2) la soluzione di dissoluzione del campione può essere aggiunta in base ai requisiti dei kit proteici per gli standard di peso molecolare; Se i campioni standard e sconosciuti sono auto-configurati, seguire la soluzione di dissoluzione del campione 0,5-1,0 mg/l. Dopo lo scioglimento, trasferiscilo sul tubo EP, metti il cappuccio (puoi aggiungere una clip sul cappuccio) e quindi scaldarlo in un bagno d'acqua a 110 gradi Celsius per 3 minuti (è possibile perforare diversi fori rotondi con lo stesso diametro del tubo EP nella piastra sottile e si è ridotta alla massima piastra, che è in lotta per la massima eca Il tubo, nel bagno di acqua bollente e la sottile piastra di polistirolo galleggia naturalmente nel bagno di acqua bollente.
Un lotto di tubi EP può essere posizionato nel bagno d'acqua bollente per tempi diversi. (Non gettare i tubi EP nel bagno d'acqua bollente, i coperchi possono essere lavati via) e quindi raffreddare a temperatura ambiente per l'uso. Se il campione non viene utilizzato per un periodo di tempo più lungo, conservare il campione in un frigorifero a -20 gradi Celsius e, quando necessario, scaldare il campione in acqua bollente a 110 gradi Celsius per 3 minuti a temperatura ambiente e raffreddarlo prima di rimuoverlo per l'uso e quindi applicare il campione per rimuovere gli aggregati di valore nelle proteine del campione.
(3) Modificare la soluzione tampone del campione in modo che il campione possa essere completamente sciolto e la quantità di SDS dovrebbe essere sufficiente.
Motivo: le bande SDS sono collegate elettroforeticamente alle proteine vicine. Oltre alla sovra-campionamento e alla dissoluzione incompleta del campione, la perdita dei pozzi del campione del gel può far allargare le bande elettroforetiche. La perdita è spesso causata da crepe tra il gel e la lastra di vetro. Contromisure: in questo momento, il gel può essere ri-preparato, il pettine dovrebbe stare attento quando si tira su la coesione del gel è completato, la velocità non dovrebbe essere troppo veloce, la direzione di sollevare dovrebbe essere perpendicolare alla superficie del gel; Per evitare crepe tra la lastra di vetro su entrambi i lati del gel e del gel, non spremere la lastra di vetro su entrambi i lati del gel nel processo di preparazione del gel.
