Определение и использование белка и использование
Белковый маркер представляет собой смесь белков известной молекулярной массы, которая используется в качестве правила 'для обозначения размера белковых полос.
В процессе вестерн -блоттинга маркер молекулярной массы похож на винт, хотя это небольшая связь, однако, это такая небольшая деталь, которая оказывает значительное влияние на экспериментальные результаты. Роль маркера в основном используется для обозначения молекулярной массы белковых полос, соответствующих размеру молекулярной массы, и только в том, что стандартные и правильные, что также выявлены, в результатах, в том числе и не являются правильными, в том, что в экспериментах также в экспериментах, в том числе и в экспериментах, в которых также есть в экспериментах. Мембрана трансфицирована или нет. Кроме того, он также показывает, является ли перенос мембраны успешным или нет, и степень электрофореза белка на геле и т. Д. Следовательно, выбор правильного белкового маркера также является одним из необходимых условий для успеха экспериментов с вестерн -блоттингом.
Классификация белковых маркеров
В целом, наиболее часто используемые белковые маркеры классифицируются на не окрашенные белковые маркеры и предварительно окрашенные белковые маркеры.
Это премиально из нескольких белков известной молекулярной массы и очищенных, что удобно для сравнения белков разных размеров. Без окрашенного в PRE маркер не так хорош, как предварительно окрашенный маркер, потому что он полностью невидим во время электрофореза и может быть указан только после окрашивания белка в конце электрофореза и не может использоваться в качестве эталона в экспериментальном процессе, который принадлежит типу 'задним числом '. Однако, поскольку белок не сопровождается молекулой красителя или молекулой маркера, показанный размер является точно оригинальным размером белка, поэтому он более точен и может точно определить размер белка.
Предварительно смешанный маркер обычно имеет несколько полос, удваивающих концентрацию в качестве показания, потому что чем больше полос смешаны, тем хуже вспомнить, кто знает, какой из них это! Трудно сосчитать, пока твои глаза не размыты. Поэтому, когда вы увидите особенно сконцентрированные, маркерные полосы будут помнить, где они находятся. Помните, однако, меньшие полосы обычно не так легко увидеть. С точки зрения отбора, конечно, лучше всего выбрать хотя бы одну из полос, которая похожа по размеру с вашми целевым белком, чем ближе, тем лучше.
Предварительно окрашенным белковым маркером представляет собой некоторые очищенные белки, смешанные вместе с ковалентной связью с красителем, который может быть непосредственно наблюдать во время электрофореза или переноса мембраны.
Предварительно окрашенные белковые маркеры удобны для наших экспериментов. Этот стандарт молекулярной массы белка может помочь нам контролировать электрофорез и оценить подвижность во время и после электрофореза, а также после переноса мембраны - например, если известно, что оптимальная зона разрешения для вертикального электрофореза составляет около 2/3 в области геля, используя предварительно окрашенную маркера. Используйте предварительно окрашенный маркер, вы можете предсказать, когда целевой белок входит в зону оптимального разрешения, и остановить электрофорез, чтобы получить оптимальный эффект разрешения; Вы также можете прекратить электрофорез вовремя, если соблюдаете аномальность в электрофорезе маркера; Кроме того, вы можете наблюдать, является ли белок полностью перенесен на мембрану после переноса мембраны в вестерн-блоттинге, и вы можете пометить молекулярную массу белка на мембране, поэтому он привлекает много лабораторий для покупки предварительно окрашенного белкового стандарта.
Стоит отметить, что предварительно окрашенный белковый маркер ковалентно связан с красителем, поэтому характеристики миграции могут меняться при электрофорезе в различных буферных условиях, что может привести к некоторым отклонениям, поэтому он не подходит для точной локализации белков - однако, в большинстве случаев, полосы на маркера не могут быть идентичными для целевого белка, и результаты, которые мы получаем, как то же самое. Однако в большинстве случаев полосы маркеров могут быть не совсем такими же, как наш целевой белок, и то, что мы получаем, является лишь эталонным размером относительно индикации маркера, и, в конце концов, нам нужно охарактеризовать его, поэтому, если нам не нужно различать полосы схожих размеров, предварительно окрашенный маркер по-прежнему очень полезен, и его также можно использовать в сочетании со стандартным стандартным белком.
Классификация предварительного белкового маркера
Предварительно окрашенные белковые маркер делится на: монохромный предварительно окрашенный и многоцветный предварительно окрашенный, монохромный предварительно окрашенный маркер белка обычно использует некоторые полосы, чтобы удвоить концентрацию определенных полос, чтобы углубить толщину некоторых полос, чтобы предположить размер их размера, чтобы мы могли быстро запоминать и дифференцировать размер отдельных полос. Цветовые белковые маркеры различаются разными цветами, что еще более узнаваемы. Более того, если красочный радужный маркер выходит в тусклый эксперимент с электрофорезом, настроение будет счастливее в это время!
В дополнение к вышесказанному на рынке есть некоторые другие типы белковых маркеров: флуоресцентные белковые маркеры, биотинилированные маркеры, развитые белковые маркеры и т. Д. ....
Кроме того, маркеры белков классифицируются на высокую молекулярную массу, низкую молекулярную массу и широкую молекулярную массу в соответствии с диапазоном молекулярной массы. Маркеры с высоким молекулярным диапазоном часто используются для больших белков молекулярной массы, в то время как маркеры малого молекулярного диапазона часто используются для небольших белков или даже некоторых пептидов. Если вы рассмотрите всю лабораторию, выберите широкие маркеры молекулярной массы с более равномерным распределением полос, чтобы ваши белки могли легко оцениваться, независимо от того, в каком интервале они находятся.
Некоторые проблемы с маркером
Например, в руководстве по инструкции перечислены 7 полос, на самом деле, нормально выбежать 6 полос, возможно, что времени выполнения недостаточно, если ваш белок не очень маленький, вы можете подождать, пока бромфенол -синий фронт, чтобы заканчиваться из геля, прежде чем выключить аппарат электрофореза, так что вы должны иметь 7 полос. Иногда будет 5 полос, но до тех пор, пока верхние и нижние две полосы вашего целевого белка могут быть заканчиваются, это не должно быть 7 полос.
Во -первых, гель не нажимается
Во -вторых, текучесть клея на краю тарелки и центра клея может быть другой, это невозможно сделать, с вязкостью и поверхностным натяжением. Если различные методы не могут решить вышеуказанное явление, производитель персональных советов, чтобы изменить канал в образце, выберите полосу движения вблизи центра плавающей полосы, чтобы пробежать.
Эффект края, на краю двух полос образца, будет таким. Вы можете попробовать более медленную скорость электрофореза ......
Либо клей не очень хорошо прижимается при его подготовке, клей плохо подготовлен, либо напряжение электрофореза слишком высокое, электроосмотическая сила сильна, или стеклянная пластина не очень хорошо зажимается во время электрофореза, а внутреннее электрофорезовое раствор протекает, пожалуйста, проверьте их по одному.
Причина 1: объем образца слишком большой, объем образца должен быть уменьшен.
Контрмеры: объем образца должен гибко контролировать в соответствии с концентрацией образца и толщиной геля. Как правило, объем образца составляет 10-15 мкл (т.е. 2-10 мкг белка). Если образец очень разбавлен, объем образца может достигать 100 мкл.
Причина 2: неполное растворение образца.
Контрмеры:
(1) Образец должен быть полностью растворен: сохранить все виды образцов белка, и маркер может быть полностью растворен до отбора проб, лучше центрифугировать образец перед отбором выборки и удалить частицы, которые не могут быть растворены.
(2) раствор растворения образца может быть добавлен в соответствии с требованиями белковых комплектов для стандартов молекулярной массы; Если стандартные и неизвестные образцы являются самооценкой, следуйте раствору растворения выборки образца 0,5-1,0 мг/л. После растворения перенесите его в EP -трубку, наведите крышку (вы можете добавить зажим в крышку), а затем нагрейте его в водяной бане при 110 градусах Цельсия в течение 3 минут (вы можете просверлить несколько круглых отверстий с тем же диаметром, что и EP -трубка в тонкой пенополистировой пластине, а затем и все, что наносит вниз, и затем поставлен на самую поверхность. из трубки EP, в кипящей водяной бане, и тонкая пенопластовая тарелка естественным образом плавает в ванной кипящей воде, накапливается на поверхности кипящей воды, что облегчает доступ и нагревать.
Партия труб EP может быть помещена в ванну с кипящей водой в разное время. (Не бросайте трубки EP в ванну с кипящей водой, крышки могут быть вымыты), а затем охладить при комнатной температуре для использования. Если образец не используется в течение более длительного периода времени, храните образец в холодильнике при -20 градусов по Цельсию, и при необходимости нагрейте образец в кипящей воде при 110 градусах Цельсия в течение 3 минут при комнатной температуре и охладите его перед удалением для использования, а затем нанесение образца, чтобы удалить сущные агрегаты в белках образца.
(3) Измените раствор буфера для образца, чтобы образец мог быть полностью растворен, а количество SD было достаточно.
Причина: полосы SDS имеют электрофоретически связаны с соседними белками. В дополнение к чрезмерной разбору и неполному растворению образца, утечка из образцов скважин геля может привести к расширению электрофоретических полос. Утечка часто вызвана трещинами между гелем и стеклянной тарелкой. Контрмеры: В настоящее время гель может быть переработан, расческа должна быть осторожна при подтягивании сплоченности геля, скорость не должна быть слишком быстрой, направление подтягивания должно быть перпендикулярно поверхности геля; Чтобы избежать трещин между стеклянной пластиной с обеих сторон геля и геля, не сжимайте стеклянную пластину с обеих сторон геля в процессе приготовления геля.
