Определение и использование белкового маркера
Белковый маркер представляет собой смесь белков с известной молекулярной массой, которая используется в качестве «линейки» для указания размера белковых полос.
В процессе вестерн-блоттинга маркер молекулярной массы похож на винт, хотя он и является небольшим звеном, однако именно такая маленькая деталь оказывает существенное влияние на результаты эксперимента. Роль маркера в основном используется для указания молекулярной массы полос белка, соответствующей размеру молекулярной массы, и только если стандартное количество точное и правильное, результаты экспериментов убедительны, помимо белка Маркер также показывает, трансфицирована мембрана или нет. Кроме того, он также показывает, успешен ли мембранный перенос или нет, а также степень электрофореза белка на геле и т. д. Поэтому выбор правильного белкового маркера также является одним из необходимых условий успеха экспериментов Вестерн-блоттинга.
Классификация белковых маркеров
В целом, наиболее часто используемые белковые маркеры делятся на неокрашенные белковые маркеры и предварительно окрашенные белковые маркеры.
Это премикс нескольких белков с известной молекулярной массой, очищенный, что удобно для сравнения белков разного размера. Неокрашенный маркер не так хорош, как предварительно окрашенный маркер, поскольку он совершенно невидим во время электрофореза и может быть обнаружен только после окрашивания белка в конце электрофореза и не может использоваться в качестве эталона в экспериментальном процессе, который относится к типу «задним числом». Однако, поскольку белок не сопровождается молекулой красителя или молекулой-маркером, показанный размер точно соответствует исходному размеру белка, поэтому он более точен и может точно определить размер белка.
Предварительно смешанный маркер обычно имеет несколько полос, удваивающих концентрацию, в качестве индикатора, потому что чем больше полос смешано, тем хуже запоминается, кто знает, какая из них та! Трудно считать, пока глаза не затуманятся. Поэтому, когда вы увидите особенно концентрированные, маркерные полосы запомнят, где они находятся. Однако помните, что меньшие полосы обычно не так легко увидеть. С точки зрения отбора, конечно, лучше всего выбрать хотя бы одну из полос, аналогичную по размеру вашему целевому белку, чем ближе, тем лучше.
Предварительно окрашенный белковый маркер представляет собой несколько очищенных белков, смешанных вместе путем ковалентного связывания с красителем, что можно непосредственно наблюдать во время электрофореза или мембранного переноса.
Предварительно окрашенные белковые маркеры удобны для наших экспериментов. Этот стандарт молекулярной массы белка может помочь нам контролировать электрофорез и оценивать подвижность во время и после электрофореза, а также после мембранного переноса - например, если известно, что оптимальная зона разрешения для вертикального электрофореза составляет около 2/3 пути через гель, с помощью предварительно окрашенного маркера можно. Например, известно, что оптимальная зона разрешения вертикального электрофореза составляет около 2/3 геля, если вы используете предварительно окрашенный маркер, вы можете предсказать, когда цель белок попадает в зону оптимального разрешения и останавливает электрофорез, чтобы получить эффект оптимального разрешения; также можно вовремя прекратить электрофорез, если вы заметили отклонения в электрофорезе Маркера; Кроме того, вы можете наблюдать, полностью ли белок переносится на мембрану после переноса мембраны с помощью вестерн-блоттинга, и вы можете маркировать молекулярную массу белка на мембране, поэтому многие лаборатории привлекают покупку предварительно окрашенного стандарта белка.
Стоит отметить, что предварительно окрашенный белок-маркер ковалентно связан с красителем, поэтому характеристики миграции могут меняться при электрофорезе в разных буферных условиях, что может привести к некоторым отклонениям, поэтому он не подходит для точной локализации белков - однако в большинстве случаев полосы на маркере могут не быть идентичны целевому белку, и результаты, которые мы получаем, точно такие же, как и у целевого белка. Однако в большинстве случаев полосы маркера могут не совпадать с нашим целевым белком, и мы получаем всего лишь эталонный размер относительно показаний маркера, и, в конце концов, нам нужен вестерн, чтобы охарактеризовать его, поэтому, если нам не нужно различать полосы схожих размеров, предварительно окрашенный маркер по-прежнему очень полезен, и его также можно использовать в сочетании с неокрашенным стандартом белка.
Классификация предварительно окрашенных белковых маркеров
Предварительно окрашенный белковый маркер делится на: монохромный предварительно окрашенный и многоцветный предварительно окрашенный, монохромный предварительно окрашенный белковый маркер обычно использует некоторые полосы для удвоения концентрации определенных полос, чтобы увеличить толщину определенных полос, чтобы указать размер их размера, чтобы мы могли быстро запомнить и различать размер отдельных полос. Цветные белковые маркеры отличаются разными цветами, что делает их еще более узнаваемыми. Более того, если в унылом эксперименте по электрофорезу получится разноцветный радужный Маркер, настроение в это время будет более радостным!
В дополнение к вышеперечисленному на рынке представлены некоторые другие типы белковых маркеров: флуоресцентные белковые маркеры, биотинилированные маркеры, разработанные белковые маркеры и т. д.
Кроме того, белковые маркеры подразделяются на высокомолекулярные, низкомолекулярные и широкие молекулярные массы в зависимости от диапазона молекулярных масс. Маркеры диапазона высокой молекулярной массы часто используются для белков с большой молекулярной массой, тогда как маркеры диапазона низкой молекулярной массы часто используются для небольших белков или даже некоторых пептидов. Если вы рассматриваете всю лабораторию, выбирайте маркеры с широкой молекулярной массой и более равномерным распределением полос, чтобы можно было легко оценить ваши белки независимо от того, в каком интервале они находятся.
Некоторые проблемы с Маркером
Например, в инструкции по эксплуатации указано 7 полос, на самом деле 6 полос - это нормально, возможно, времени работы недостаточно, если ваш белок не очень маленький, вы можете подождать, пока фронт бромфенолового синего закончится из геля, прежде чем выключать аппарат для электрофореза, чтобы у вас было 7 полос. Иногда будет 5 полос, но если две верхние и нижние полосы вашего целевого белка могут закончиться, это не обязательно должно быть 7 полос.
Во-первых, гель не прессуется
Во-вторых, текучесть клея у края пластины и в центре клея может быть разной, сделать это невозможно, с учетом вязкости и поверхностного натяжения. Если различные методы не могут решить вышеуказанное явление, личный советчик должен изменить канал на образце и выбрать полосу рядом с центром дорожки для плавания, чтобы запустить пробежку.
Краевой эффект на границе двух полос образца будет таким. Вы можете попробовать более медленную скорость электрофореза......
Либо клей плохо прижат при приготовлении, либо клей плохо подготовлен, либо напряжение электрофореза слишком высокое, электроосмотическая сила сильная, либо стеклянная пластина плохо зажимается во время электрофореза, и внутренний раствор для электрофореза протекает, проверьте их один за другим.
Причина 1: объем пробы слишком велик, следует уменьшить объем пробы.
Контрмера: объем пробы следует гибко контролировать в зависимости от концентрации пробы и толщины геля. Обычно объем образца составляет 10–15 мкл (т. е. 2–10 мкг белка). Если образец очень разбавлен, объем образца может достигать 100 мкл.
Причина 2: Неполное растворение образца.
Контрмеры:
(1) Образец должен быть полностью растворен: храните все виды образцов белка, и маркер может быть полностью растворен перед отбором проб. Лучше центрифугировать образец перед отбором проб и удалить частицы, которые не могут быть растворены.
(2) Раствор для растворения образца может быть добавлен в соответствии с требованиями наборов белков для стандартов молекулярной массы; если стандартные и неизвестные образцы настроены самостоятельно, используйте раствор для растворения образца 0,5–1,0 мг/л. После растворения перенесите его в пробирку, наденьте колпачок (можно добавить зажим на крышку), а затем нагрейте на водяной бане при 110 градусах Цельсия в течение 3 минут (можно просверлить несколько круглых отверстий того же диаметра, что и пробирка, в тонкой пенопластовой пластине, и пробирку опустить до тех пор, пока край колпачка не будет ограничен от дальнейшего опускания, а затем положить тонкую пенопластовую пластину, обнажающую большую часть тела). трубки Ep в кипящей водяной бане, а тонкая пластина из пенополистирола естественным образом плавает в кипящей водяной бане. Тонкий лист пенополистирола естественным образом плавает на поверхности кипящей воды, что облегчает доступ и нагрев и позволяет избежать разбрызгивания кипящей воды.
Партию пробирок Ep можно поместить в кипящую водяную баню на разное время. (Не бросайте пробирки Ep в кипящую водяную баню, крышки можно смыть), а затем охладите при комнатной температуре для использования. Если образец не используется в течение длительного периода времени, храните образец в холодильнике при температуре -20 градусов Цельсия, а при необходимости нагрейте образец в кипящей воде при температуре 110 градусов Цельсия в течение 3 минут при комнатной температуре и охладите его перед тем, как вынуть его для использования, а затем нанесите образец для удаления субстабильных агрегатов в белках образца.
(3) Замените буферный раствор для образца так, чтобы образец мог полностью раствориться, а количество SDS должно быть достаточным.
Причина: полосы SDS электрофоретически связаны с соседними белками. Помимо избыточного отбора проб и неполного растворения образца, утечка геля из лунок для образца может привести к расширению электрофоретических полос. Утечка часто вызвана трещинами между гелем и стеклянной пластиной. Меры противодействия: в это время гель можно только подготовить повторно, расческа должна быть осторожной, когда вытягивание геля будет завершено, скорость не должна быть слишком высокой, направление вытягивания должно быть перпендикулярно поверхности геля; Во избежание образования трещин между стеклянной пластинкой с обеих сторон геля и гелем не сжимайте стеклянную пластину с обеих сторон геля в процессе приготовления геля.
