Proteinmarkør | Hvordan velge | Problemanalyse

Definisjon og bruk av proteinkarerer

Proteindarkør er en blanding av proteiner med kjent molekylvekt, som brukes som en 'linjal ' for å indikere størrelsen på proteinbånd.

I prosessen med Western blot er molekylvektmarkøren som en skrue, selv om det er en liten kobling, er det imidlertid en så liten detalj som har en betydelig effekt på de eksperimentelle resultatene. Marker viser også om membranen er transfektert eller ikke. I tillegg viser det også om membranoverføringen er vellykket eller ikke, og graden av elektroforese av proteinet på gelen, etc. Derfor er det å velge riktig proteinmarkør også en av de nødvendige forholdene for suksessen til Western blot -eksperimenter.

Klassifisering av proteinmarkører

Generelt er de mest brukte proteinmarkørene kategorisert i ikke-pre-fargede proteinmarkører og forhåndsfargede proteinmarkører.

• Ikke-pre-farget proteinmarkør

Det er en forblanding av flere proteiner med kjent molekylvekt og renset, noe som er praktisk for sammenligning av proteiner i forskjellige størrelser. Ikke-pre-farget markør er ikke så god som forhåndsfarget markør fordi den er helt usynlig under elektroforese, og bare kan indikeres etter proteinfarging ved slutten av elektroforesen, og kan ikke brukes som referanse i den eksperimentelle prosessen, som tilhører typen 'hindring '. Siden proteinet ikke er ledsaget av et fargestoffmolekyl eller et markørmolekyl, er imidlertid størrelsen som er vist nøyaktig den opprinnelige størrelsen på proteinet, så det er mer nøyaktig og kan bestemme proteinets størrelse nøyaktig.

Forblandet markør har vanligvis noen få bånd som dobler konsentrasjonen som en indikasjon, fordi jo flere bånd er blandede, jo verre er det å huske, hvem vet hvilken som er den! Det er vanskelig å telle til øynene dine er uskarpe. Så når du ser de spesielt konsentrerte, vil markørbandene huske hvor de er. Husk at de mindre bandene vanligvis ikke er like enkle å se. Når det gjelder valg, er det selvfølgelig best å velge minst ett av båndene som er likt i størrelse som målproteinet ditt, jo nærmere, jo bedre.

• Prested proteinmarkør

Forfarget proteinmarkør er noen rensede proteiner blandet sammen ved kovalent kobling med et fargestoff, som kan observeres direkte under elektroforese eller membranoverføring.

Forfargede proteinmarkører er praktisk for eksperimentene våre. Denne proteinmolekylvektstandarden kan hjelpe oss 2/3 av gelen, hvis du bruker en forhåndsfarget markør, kan du forutsi når målproteinet kommer inn i den optimale oppløsningssonen og stopper elektroforesen for å få den optimale oppløsningseffekten; Du kan også avslutte elektroforesen i tide hvis du observerer en abnormitet i elektroforesen av markøren; I tillegg kan du observere om proteinet overføres fullstendig til membranen etter overføring av membranen i Western blot, og du kan merke molekylvekten til proteinet på membranen, og det er derfor det tiltrekker seg mange laboratorier for å kjøpe den forhåndsfargede proteinstandarden.

Det er verdt å merke seg at den forhåndsfargede proteindarkøren er kovalent koblet med fargestoffet, slik at migrasjonskarakteristikkene kan endre I de fleste tilfeller er det ikke sikkert at markørbåndene er nøyaktig de samme som målproteinet vårt, og det vi får er bare en referansestørrelse i forhold til markørindikasjonen, og til slutt trenger vi Western for å karakterisere det, så hvis vi ikke trenger å skille mellom bånd av lignende størrelser, er den forhåndsfargede markøren fortsatt nyttig, og den kan brukes i Con-Enstion med den ustable.

Klassifisering av den fremste proteinmarkøren

Forbeiset proteinmarkør er delt inn i: monokrom forhåndsfarget og flerfarget forhåndsfarget, monokrom forhåndsfarget proteinmarkør vil vanligvis bruke noen av båndene for å doble konsentrasjonen av visse bånd for å utdype tykkelsen på visse bånd for å antyde størrelsen på størrelsen. Fargeproteinmarkører kjennetegnes med forskjellige farger, noe som er enda mer gjenkjennelig. Dessuten, hvis en fargerik regnbuemarkør kommer ut i et kjedelig elektroforeseeksperiment, vil stemningen være lykkeligere på dette tidspunktet!

I tillegg til det ovennevnte, er det noen andre typer proteinmarkører på markedet: fluorescerende proteinkarkere, biotinylerte markører, utviklede proteinkarkere osv. ....

I tillegg kategoriseres proteinmarkører i høy molekylvekt, lav molekylvekt og bred molekylvekt i henhold til molekylvektområdet. Markører med høy molekylvektområde brukes ofte til proteiner med store molekylvekt, mens små molekylvektområde markører ofte brukes til små proteiner eller til og med noen peptider. Hvis du vurderer hele laboratoriet, velger du brede molekylvektmarkører med mer ensartet båndfordeling, slik at proteinene dine lett kan bedømmes uansett hvilket intervall de er i.

Noen problemer med markør

• Må alle markørene gå tom?

For eksempel lister bruksanvisningen 7 bånd, det er faktisk normalt å løpe ut 6 bånd, det kan være at løpetiden ikke er nok, hvis proteinet ditt ikke er veldig lite, kan du vente til bromofenolblå fronten skal løpe ut av gelen før du slår av elektroforeseapparatet, slik at du bør kunne ha 7 bånd. Noen ganger vil det være 5 bånd, men så lenge de øvre og nedre to båndene i målproteinet ditt kan kjøres tom, trenger det ikke å være 7 bånd.

• Hva skal jeg gjøre hvis markøren blir til et smilefjes?

Først presses ikke gelen

For det andre kan limets fluiditet på kanten av platen og midten av limet være annerledes, det er ingen måte å gjøre dette på, med viskositet og overflatespenning. Hvis en rekke metoder ikke kan løse ovennevnte fenomen, personlige rådgivningsprodusenter for å endre en kanal på prøven, velger du en bane nær midten av svømmebanen for å løpe et løp.

Kanteffekt, i utkanten av de to banene i prøven vil være slik. Du kan prøve saktere elektroforesehastighet ...

Enten er limet ikke godt presset når det tilberedes, limet er ikke godt tilberedt, eller elektroforesespenningen er for høy, den elektroosmotiske kraften er sterk, eller glassplaten ikke er godt klemt under elektroforesen, og den indre elektroforeseoppløsningen lekker, sjekk dem en etter en.

• Hvordan løse problemet med utvidelse av markørbånd?

Årsak 1: Prøvenes volum er for mye, utvalget av prøven skal reduseres.

Motmåling: Prøvevolumet skal kontrolleres fleksibelt i henhold til prøvekonsentrasjonen og geldykkelsen. Generelt er prøvevolumet 10-15μL (dvs. 2-10μg protein). Hvis prøven er veldig fortynnet, kan prøvevolumet nå 100μL.

Årsak 2: Ufullstendig oppløsning av prøven.

Motmål:

(1) Prøven skal oppløses fullt ut: Oppbevar alle slags proteinprøver, og markøren kan oppløses fullstendig før prøvetaking, er det bedre å sentrifuge prøven før prøvetaking, og fjerne partiklene som ikke kan løses.

(2) prøveoppløsningsløsning kan tilsettes i henhold til kravene til proteinkit for standarder for molekylvekt; Hvis standard- og ukjente prøvene er selvkonfigurerte, følg 0,5-1,0 mg/l prøveoppløsningsløsning. Etter oppløsning, overfør den til EP -røret, sett hetten på (du kan legge til et klipp i hetten) og varm den deretter i et vannbad på 110 grader Celsius i 3 minutter (du kan bore flere runde hull med samme diameter som EPO i den tynne styrofoam -platen, og EP -røret er stengt til å tette på en tyr som er tydet til å gå nedover, og det er å gå nedover, og den er en styrplate, og den er en styrplate, og den er en styrplate, og den er talt. av EP -røret, i det kokende vannbadet, og den tynne styrofoamplaten flyter naturlig i det kokende vannbadet.

En gruppe EP -rør kan plasseres i det kokende vannbadet i forskjellige tider. (Ikke kast EP -rørene i det kokende vannbadet, lokkene kan vaskes av) og deretter avkjøles ved romtemperatur for bruk. Hvis prøven ikke brukes i en lengre periode, må du lagre prøven i kjøleskap med -20 grader Celsius, og når det er nødvendig, varm prøven i kokende vann ved 110 grader Celsius i 3 minutter ved romtemperatur og avkjøl den før du fjerner den for bruk og påfør deretter prøven for å fjerne de store aggregatene i prøveproteinene.

(3) Endre prøvebufferløsningen slik at prøven kan oppløses fullstendig og mengden SDS skal være tilstrekkelig.

Årsak: SDS -bånd er elektroforetisk knyttet til naboproteiner. I tillegg til over-sampling og ufullstendig oppløsning av prøven, kan lekkasje av prøvebrønnene til gelen føre til at de elektroforetiske båndene utvides. Lekkasjen er ofte forårsaket av sprekker mellom gelen og glassplaten. Motmål: På dette tidspunktet kan gelen bare tilberedes, kammen skal være forsiktig når du trekker opp gel-samholdet er fullført, hastigheten skal ikke være for rask, retningen for å trekke opp skal være vinkelrett på overflaten av gelen; For å unngå sprekker mellom glassplaten på begge sider av gelen og gelen, ikke klem glassplaten på begge sider av gelen i prosessen med gelforberedelse.