Proteinmarkør Definisjon og bruk
Protein Marker er en blanding av proteiner med kjent molekylvekt, som brukes som en «linjal» for å indikere størrelsen på proteinbånd.
I prosessen med Western Blot er molekylvektsmarkøren som en skrue, selv om det er en liten lenke, men det er en så liten detalj som har en betydelig effekt på de eksperimentelle resultatene. Markørens rolle brukes hovedsakelig til å indikere molekylvekten til proteinbåndene som tilsvarer størrelsen på molekylvekten, og bare hvis standardmengden av nøyaktig og korrekt, viser resultatene av de transfekterte membranen også i tillegg til proteinmarkeringseksperimentene i tillegg til proteinmarkeringseksperimentene. eller ikke. I tillegg viser den også om membranoverføringen er vellykket eller ikke, og graden av elektroforese av proteinet på gelen osv. Derfor er valg av riktig proteinmarkør også en av de nødvendige betingelsene for å lykkes med Western Blot-eksperimenter.
Klassifisering av proteinmarkører
Generelt er de mest brukte proteinmarkørene kategorisert i ikke-pre-fargede proteinmarkører og pre-fargede proteinmarkører.
Det er en forblanding av flere proteiner med kjent molekylvekt og renset, noe som er praktisk for sammenligning av proteiner av forskjellige størrelser. Non-pre-stained Marker er ikke like god som pre-stained Marker fordi den er helt usynlig under elektroforese, og kan kun indikeres etter proteinfarging på slutten av elektroforese, og kan ikke brukes som referanse i den eksperimentelle prosessen, som hører til typen «hindsight». Men siden proteinet ikke er ledsaget av et fargestoffmolekyl eller et markørmolekyl, er størrelsen som vises nøyaktig den opprinnelige størrelsen på proteinet, så det er mer nøyaktig og kan nøyaktig bestemme størrelsen på proteinet.
Pre-mixed Marker har vanligvis noen få band som dobler konsentrasjonen som en indikasjon, for jo flere band som blandes, jo verre er det å huske, hvem vet hvilket er det! Det er vanskelig å telle før øynene dine er uskarpe. Så når du ser de spesielt konsentrerte, vil markørbåndene huske hvor de er. Husk imidlertid at de mindre båndene vanligvis ikke er like enkle å se. Når det gjelder utvalg, er det selvfølgelig best å velge minst ett av båndene som er like i størrelse som målproteinet ditt, jo nærmere jo bedre.
Forhåndsfarget proteinmarkør er noen rensede proteiner blandet sammen ved kovalent kobling med et fargestoff, som kan observeres direkte under elektroforese eller membranoverføring.
Forhåndsfargede proteinmarkører er praktiske for våre eksperimenter. Denne proteinmolekylvektstandarden kan hjelpe oss med å overvåke elektroforese og estimere mobilitet under og etter elektroforese, så vel som etter membranoverføring - for eksempel hvis det er kjent at den optimale oppløsningssonen for vertikal elektroforese er omtrent 2/3 av veien gjennom gelen, ved å bruke en forhåndsfarget markør er det mulig å For eksempel er det kjent at hvis du bruker optimal oppløsningssone for en vertikal,/3 forhåndsfarget markør, du kan forutsi når målproteinet kommer inn i den optimale oppløsningssonen og stoppe elektroforesen for å få optimal oppløsningseffekt; du kan også avslutte elektroforesen i tide hvis du observerer en abnormitet i elektroforesen til markøren; i tillegg kan du observere om proteinet overføres fullstendig til membranen etter overføring av membran i Western Blot og du kan merke molekylvekten til proteinet på membranen, og det er derfor det tiltrekker seg mange laboratorier til å kjøpe den forhåndsfargede proteinstandarden.
Det er verdt å merke seg at den forhåndsfargede proteinmarkøren er kovalent koblet med fargestoffet, så migrasjonsegenskapene kan endres ved elektroforese under forskjellige bufferforhold, noe som kan føre til noen avvik, så det er ikke egnet for presis lokalisering av proteiner - men i de fleste tilfeller er båndene på markøren kanskje ikke identiske med målproteinet, og de samme resultatene som målproteinet er. Imidlertid er det i de fleste tilfeller at Marker-båndene ikke er nøyaktig det samme som målproteinet vårt, og det vi får er bare en referansestørrelse i forhold til Marker-indikasjonen, og til syvende og sist trenger vi Western for å karakterisere den, så hvis vi ikke trenger å skille mellom bånd av lignende størrelser, er den forhåndsfargede Markeren fortsatt veldig nyttig, og den kan også brukes sammen med det ikke-sammensatte proteinet.
Klassifisering av Pretained Protein Marker
Forhåndsfarget proteinmarkør er delt inn i: monokrom forhåndsfarget og flerfarget forhåndsfarget, monokrom forhåndsfarget proteinmarkør vil vanligvis bruke noen av båndene til å doble konsentrasjonen av visse bånd for å utdype tykkelsen på visse bånd for å foreslå størrelsen på deres størrelse, slik at vi raskt kan huske og skille mellom størrelsen på de enkelte båndene. Fargeproteinmarkører kjennetegnes av forskjellige farger, noe som er enda mer gjenkjennelig. Dessuten, hvis en fargerik regnbuemarkør kommer ut i et kjedelig elektroforese-eksperiment, vil stemningen være lykkeligere på dette tidspunktet!
I tillegg til ovennevnte er det noen andre typer proteinmarkører på markedet: fluorescerende proteinmarkører, biotinylerte markører, utviklet proteinmarkører, etc....
I tillegg er proteinmarkører kategorisert i høy molekylvekt, lav molekylvekt og bred molekylvekt i henhold til molekylvektområdet. Markører med høy molekylvekt brukes ofte til proteiner med stor molekylvekt, mens markører med lav molekylvekt ofte brukes til små proteiner eller til og med noen peptider. hvis du vurderer hele laboratoriet, velg brede molekylvektsmarkører med mer jevn båndfordeling, slik at proteinene dine enkelt kan bedømmes uansett hvilket intervall de befinner seg i.
Noen problemer med Marker
For eksempel viser bruksanvisningen 7 bånd, faktisk er det normalt å gå tom for 6 bånd, det kan være at kjøretiden ikke er nok, hvis proteinet ditt ikke er veldig lite kan du vente på at bromfenolblå fronten renner ut av gelen før du slår av elektroforeseapparatet, slik at du skal kunne ha 7 bånd. Noen ganger vil det være 5 bånd, men så lenge de øvre og nedre to båndene av målproteinet ditt kan gå tom, trenger det ikke å være 7 bånd.
For det første presses ikke gelen
For det andre kan fluiditeten til limet ved kanten av platen og midten av limet være forskjellig, det er ingen måte å gjøre dette på, med viskositeten og overflatespenningen. Hvis en rekke metoder ikke kan løse ovennevnte fenomen, personlig råd maker å endre en kanal på prøven, velg en bane nær midten av svømmebanen for å løpe.
Kanteffekt, ved kanten av de to banene til prøven vil være slik. Du kan prøve lavere elektroforesehastighet ......
Enten er limet ikke godt presset når det er forberedt, limet er ikke godt forberedt, eller elektroforesespenningen er for høy, den elektroosmotiske kraften er sterk, eller glassplaten er ikke godt fastklemt under elektroforese, og den indre elektroforeseløsningen lekker, vennligst sjekk dem en etter en.
Årsak 1: Prøvevolumet er for stort, prøvevolumet bør reduseres.
Mottiltak: Prøvevolumet bør være fleksibelt kontrollert i henhold til prøvekonsentrasjonen og geltykkelsen. Vanligvis er prøvevolumet 10-15μL (dvs. 2-10μg protein). Hvis prøven er svært fortynnet, kan prøvevolumet nå 100μL.
Årsak 2: Ufullstendig oppløsning av prøven.
Mottiltak:
(1) Prøven skal være fullstendig oppløst: behold alle typer proteinprøver og Marker kan løses helt opp før prøvetaking, det er bedre å sentrifugere prøven før prøvetaking, og fjerne partiklene som ikke kan løses.
(2) Prøveoppløsningsløsning kan tilsettes i henhold til kravene til proteinsett for molekylvektstandarder; hvis standard og ukjente prøvene er selvkonfigurerte, følg 0,5-1,0 mg/L prøveoppløsningsløsning. Etter oppløsning overfører du det til Ep-røret, setter hetten på (du kan legge til en klips ved hetten) og deretter varmes det opp i vannbad ved 110 grader Celsius i 3 minutter (du kan bore flere runde hull med samme diameter som Ep-røret i den tynne isoporplaten, og Ep-røret settes ned til kanten av korken blir lenger ned, og deretter legges det lenger ned, og deretter holdes styrofonen nedover. eksponerer det meste av Ep-rørets kropp, i det kokende vannbadet, og den tynne isoporplaten flyter naturlig i det kokende vannbadet. Den tynne isoporplaten flyter naturlig på overflaten av det kokende vannet, noe som gjør det lettere å få tilgang til og varme opp, og unngår sprut av det kokende vannet.
Et parti med Ep-rør kan plasseres i det kokende vannbadet til forskjellige tider. (Ikke kast Ep-rørene i det kokende vannbadet, lokkene kan vaskes av) og avkjøl deretter ved romtemperatur for bruk. Hvis prøven ikke brukes over lengre tid, oppbevar prøven i kjøleskap ved -20 grader Celsius, og ved behov, varm opp prøven i kokende vann ved 110 grader Celsius i 3 minutter ved romtemperatur og avkjøl den før den tas ut for bruk og deretter påføres prøven for å fjerne de substabile aggregatene i prøveproteinene.
(3) Bytt prøvebufferløsningen slik at prøven kan være fullstendig oppløst og mengden av SDS skal være tilstrekkelig.
Årsak: SDS-bånd er elektroforetisk knyttet til naboproteiner. I tillegg til overprøvetaking og ufullstendig oppløsning av prøven, kan lekkasje av prøvebrønnene til gelen føre til at de elektroforetiske båndene utvides. Lekkasjen er ofte forårsaket av sprekker mellom gelen og glassplaten. Mottiltak: På dette tidspunktet kan gelen bare klargjøres på nytt, kammen skal være forsiktig når du trekker opp gelens kohesjon er fullført, hastigheten bør ikke være for høy, retningen for å trekke opp skal være vinkelrett på overflaten av gelen; For å unngå sprekker mellom glassplaten på begge sider av gelen og gelen, må du ikke klemme glassplaten på begge sider av gelen mens gelen forberedes.
