Definice a použití proteinových markerů
Protein Marker je směs proteinů o známé molekulové hmotnosti, která se používá jako 'pravítko' k označení velikosti proteinových pásů.
V procesu Western Blot je marker molekulové hmotnosti jako šroub, i když je to malý článek, ale je to takový malý detail, který má významný vliv na výsledky experimentu. Role markeru se používá především k indikaci molekulové hmotnosti proteinových pásů odpovídající velikosti molekulové hmotnosti a pouze v případě, že standardní množství přesné a správné, výsledky experimentů ukazují, zda jsou kromě proteinu také transfektované nebo netransfektované. Kromě toho také ukazuje, zda je přenos membránou úspěšný či nikoli, a stupeň elektroforézy proteinu na gelu atd. Výběr správného proteinového markeru je proto také jednou z nezbytných podmínek úspěchu experimentů Western Blot.
Klasifikace proteinových markerů
Obecně jsou nejběžněji používané proteinové markery kategorizovány na proteinové markery bez předbarvení a předbarvené proteinové markery.
Jedná se o premix několika proteinů o známé molekulové hmotnosti a purifikovaných, což je vhodné pro srovnání proteinů různých velikostí. Nepředbarvený marker není tak dobrý jako předem obarvený marker, protože je během elektroforézy zcela neviditelný a může být indikován pouze po barvení proteinu na konci elektroforézy a nemůže být použit jako reference v experimentálním procesu, který patří k typu 'zpětného pohledu'. Protože však protein není doprovázen molekulou barviva nebo molekulou markeru, uvedená velikost je přesně původní velikostí proteinu, takže je přesnější a může přesně určit velikost proteinu.
Premixed Marker má obvykle několik kapel, které zdvojnásobují koncentraci, protože čím více kapel je smícháno, tím hůře se pamatuje, kdo ví, která to je! Je těžké to spočítat, dokud se vám nezamlží oči. Takže když uvidíte ty obzvláště koncentrované, fixy si zapamatují, kde jsou. Pamatujte však, že menší pásy obvykle nejsou tak snadno vidět. Z hlediska výběru je samozřejmě nejlepší zvolit alespoň jedno z pásů, které je velikostí podobné vašemu cílovému proteinu, čím blíže, tím lépe.
Pre-stained Protein Marker jsou některé purifikované proteiny smíchané dohromady kovalentní vazbou s barvivem, které lze přímo pozorovat během elektroforézy nebo membránového přenosu.
Předbarvené proteinové markery jsou vhodné pro naše experimenty. Tento standard molekulové hmotnosti proteinu nám může pomoci monitorovat elektroforézu a odhadnout pohyblivost během a po elektroforéze, stejně jako po přenosu membrány - například pokud je známo, že optimální zóna rozlišení pro vertikální elektroforézu je asi 2/3 cesty gelem, pomocí předem obarveného markeru je možné například je známo, že optimální zóna rozlišení vertikální elektroforézy je přibližně 3, pokud použijete gel, můžete předpovědět přibližně 2 cílový protein vstoupí do zóny optimálního rozlišení a zastaví elektroforézu, aby se dosáhlo optimálního efektu rozlišení; elektroforézu můžete také ukončit včas, pokud pozorujete abnormalitu v elektroforéze Markeru; kromě toho můžete pozorovat, zda se protein po přenosu membrány úplně přenese na membránu ve Western Blot a můžete označit molekulovou hmotnost proteinu na membráně, proto láká spoustu laboratoří koupit předbarvený proteinový standard.
Stojí za zmínku, že předem obarvený proteinový marker je kovalentně spojen s barvivem, takže migrační charakteristiky se mohou změnit při elektroforéze za různých podmínek pufru, což může vést k určitým odchylkám, takže není vhodný pro přesnou lokalizaci proteinů - nicméně ve většině případů nemusí být pásy na markeru totožné s cílovým proteinem a výsledky, které dostáváme, jsou stejné jako u cílového proteinu. Ve většině případů však proužky markerů nemusí být přesně stejné jako náš cílový protein a to, co získáme, je pouze referenční velikost vzhledem k indikaci markeru, a nakonec potřebujeme Western, abychom to charakterizovali, takže pokud nepotřebujeme rozlišovat mezi pruhy podobných velikostí, je předbarvený marker stále velmi užitečný a lze jej také použít ve spojení se standardem nebarveného proteinu.
Klasifikace Prestained Protein Marker
Předbarvený proteinový Marker se dělí na: monochromatický předbarvený a vícebarevný předbarvený, monochromatický předbarvený proteinový Marker obvykle využije některé z proužků ke zdvojnásobení koncentrace určitých proužků k prohloubení tloušťky určitých proužků k naznačení velikosti jejich velikosti, abychom si mohli rychle zapamatovat a rozlišit velikost jednotlivých proužků. Barevné proteinové markery jsou odlišeny různými barvami, což je ještě lépe rozpoznatelné. Navíc, pokud v experimentu s nudnou elektroforézou vyjde barevná duhová značka, nálada bude v tuto chvíli veselejší!
Kromě výše uvedených jsou na trhu některé další typy proteinových markerů: fluorescenční proteinové markery, biotinylované markery, vyvinuté proteinové markery atd....
Kromě toho jsou proteinové markery rozděleny do kategorií s vysokou molekulovou hmotností, nízkou molekulovou hmotností a širokou molekulovou hmotností podle rozsahu molekulové hmotnosti. Markery s vysokou molekulovou hmotností se často používají pro proteiny s velkou molekulovou hmotností, zatímco markery s nízkou molekulovou hmotností se často používají pro malé proteiny nebo dokonce některé peptidy. pokud vezmete v úvahu celou laboratoř, vyberte markery se širokou molekulovou hmotností s rovnoměrnější distribucí pásem, aby bylo možné vaše proteiny snadno posoudit bez ohledu na to, v jakém intervalu se nacházejí.
Nějaké problémy s Markerem
Například návod k použití uvádí 7 pásů, ve skutečnosti je normální vyčerpat 6 pásů, může se stát, že doba běhu nestačí, pokud váš protein není příliš malý, můžete před vypnutím elektroforézy počkat, až bromfenolová modř vyteče z gelu, takže byste měli být schopni mít 7 pásů. Někdy bude 5 pásů, ale pokud mohou být horní a spodní dva pásy vašeho cílového proteinu vyčerpány, nemusí to být 7 pásů.
Za prvé, gel není lisovaný
Za druhé, tekutost lepidla na okraji desky a ve středu lepidla se může lišit, neexistuje způsob, jak to udělat, s viskozitou a povrchovým napětím. Pokud výše uvedený jev nelze vyřešit různými metodami, může osobní poradce změnit kanál na vzorku a vybrat dráhu blízko středu dráhy pro běh.
Efekt okraje, na okraji dvou pruhů vzorku bude takový. Můžete zkusit nižší rychlost elektroforézy......
Buď není lepidlo při přípravě dobře slisováno, lepidlo není dobře připraveno, nebo je elektroforézní napětí příliš vysoké, elektroosmotická síla je silná nebo skleněná deska není během elektroforézy dobře upnutá a vnitřní elektroforézní roztok uniká, zkontrolujte je prosím jeden po druhém.
Příčina 1: Objem vzorku je příliš velký, objem vzorku by měl být snížen.
Protiopatření: Objem vzorku by měl být flexibilně řízen podle koncentrace vzorku a tloušťky gelu. Obecně je objem vzorku 10-15μL (tj. 2-10μg proteinu). Pokud je vzorek velmi zředěný, objem vzorku může dosáhnout 100 μl.
Příčina 2: Neúplné rozpuštění vzorku.
Protiopatření:
(1) Vzorek by měl být zcela rozpuštěn: uchovávejte všechny druhy proteinových vzorků a Marker může být před vzorkováním zcela rozpuštěn, je lepší vzorek před vzorkováním odstředit a odstranit částice, které nelze rozpustit.
(2) Roztok pro rozpouštění vzorku lze přidat podle požadavků proteinových souprav pro standardy molekulové hmotnosti; pokud jsou standardní a neznámé vzorky konfigurovány samostatně, postupujte podle 0,5-1,0 mg/l roztoku pro rozpouštění vzorku. Po rozpuštění přeneste do Ep trubice, nasaďte uzávěr (můžete přidat klip na uzávěr) a poté jej zahřívejte ve vodní lázni při 110 stupních Celsia po dobu 3 minut (můžete vyvrtat několik kulatých otvorů o stejném průměru jako Ep trubice v tenké polystyrénové desce a Ep trubice je položena, dokud okraj uzávěru není omezen, a pak se nedaří klesnout dále a neklesne dolů. těla Ep trubice, ve vroucí vodní lázni, a tenká polystyrenová deska přirozeně plave ve vroucí vodní lázni Tenká polystyrenová deska přirozeně plave na povrchu vroucí vody, což usnadňuje přístup a ohřev a zabraňuje rozstřikování vařící vody.
Dávku Ep zkumavek lze umístit do vroucí vodní lázně na různé doby. (Neházejte Ep zkumavky do vroucí vodní lázně, víčka mohou být omyta) a poté ochlaďte na pokojovou teplotu pro použití. Pokud vzorek delší dobu nepoužíváte, uchovávejte vzorek v chladničce při -20 stupních Celsia a v případě potřeby zahřejte vzorek ve vroucí vodě o 110 stupních Celsia po dobu 3 minut při pokojové teplotě a před vyjmutím k použití jej ochlaďte a poté naneste vzorek k odstranění substabilních agregátů ve vzorku proteinů.
(3) Vyměňte roztok vzorkového pufru tak, aby bylo možné vzorek zcela rozpustit a množství SDS by mělo být dostatečné.
Důvod: Pásy SDS jsou elektroforeticky spojeny se sousedními proteiny. Kromě nadměrného odběru vzorků a neúplného rozpuštění vzorku může únik z jamek gelu způsobit rozšíření elektroforetických pásů. Únik je často způsoben prasklinami mezi gelem a skleněnou deskou. Protiopatření: V tuto chvíli lze gel pouze znovu připravit, hřeben by měl být opatrný při vytahování je dokončena soudržnost gelu, rychlost by neměla být příliš vysoká, směr vytahování by měl být kolmý k povrchu gelu; Abyste se vyhnuli prasklinám mezi skleněnou destičkou na obou stranách gelu a gelem, nemačkejte během přípravy gelu skleněnou destičku na obou stranách gelu.
