Proteinová marker | Jak vybrat | Analýza problému

Definice a použití proteinového markeru

Proteinový marker je směs proteinů známé molekulové hmotnosti, která se používá jako 'vládce ' k označení velikosti proteinových pásů.

V procesu Western blotu je marker molekulové hmotnosti jako šroub, i když je to malý spojení, je to však takový malý detail, který má významný vliv na experimentální výsledky. membrána je transfekována nebo ne. Kromě toho také ukazuje, zda je přenos membrány úspěšný nebo ne, a stupeň elektroforézy proteinu na gelu atd. Proto je výběr správného proteinového markeru také jednou z nezbytných podmínek pro úspěch experimentů Western blot.

Klasifikace proteinových markerů

Obecně jsou nejčastěji používané proteinové markery kategorizovány do ne-pre-obarvených proteinových markerů a předem obarvených proteinových markerů.

• Nepřikvrněný proteinový marker

Je to premix několika proteinů známé molekulové hmotnosti a purifikovaných, což je vhodné pro srovnání proteinů různých velikostí. Marker bez obarvení není tak dobrý jako předem obarvená marker, protože je zcela neviditelná během elektroforézy a může být indikována pouze po proteinovém barvení na konci elektroforézy a nelze jej použít jako odkaz v experimentálním procesu, který patří k typu 'zadní pohled '. Protože však protein není doprovázen molekulou barviva nebo molekulou markeru, zobrazená velikost je přesně původní velikost proteinu, takže je přesnější a může přesně určit velikost proteinu.

Předem smíšená značka obvykle má několik pásů, které koncentraci zdvojnásobí jako indikaci, protože čím více pásů je smíšeno, tím horší je pamatovat, kdo ví, který z nich je ten! Je těžké spočítat, dokud nebudou vaše oči rozmazané. Takže když uvidíte zvláště koncentrované, že si značkové pásky pamatují, kde jsou. Nezapomeňte však, že menší kapely obvykle nejsou tak snadné vidět. Pokud jde o výběr, samozřejmě je nejlepší zvolit alespoň jeden z pásů, který má podobný velikost jako váš cílový protein, tím bližší, tím lépe.

• Prezistený proteinový marker

Předem obarvené proteinové marker je některé purifikované proteiny smíchané dohromady kovalentní vazbou s barvivem, které lze přímo pozorovat během přenosu elektroforézy nebo membrány.

Pro naše experimenty jsou vhodné proteinové markery. Tento standard proteinového molekulového hmotnosti nám může pomoci sledovat elektroforézu a odhadnout mobilitu během a po elektroforéze a po něm, jakož i po přenosu membrány - například pokud je známo, že optimální zóna rozlišení pro svislou elektroforézu je asi 2/3 cesty skrz gel, pokud je to možné, je možné, že je možné, že je to, pokud je to, pokud je to, pokud je to, pokud je to, pokud je to, že je to, pokud je to, pokud je to, pokud je to, že je to, že je to, pokud je to, pokud je to gel, že je to gel. Použijte předem obarvenou markeru, můžete předvídat, kdy cílový protein vstoupí do zóny optimálního rozlišení a zastaví elektroforézu, aby se získalo efekt optimálního rozlišení; Elektroforézu můžete také ukončit včas, pokud pozorujete abnormalitu v elektroforéze markeru; Kromě toho můžete pozorovat, zda je protein po přenosu membrány v západním přenosu zcela přenesen na membránu a můžete označit molekulovou hmotnost proteinu na membránu, a proto přitahuje mnoho laboratoří k nákupu předkrytého proteinového standardu.

Stojí za zmínku, že předem obarvený proteinový marker je kovalentně spojený s barvivem, takže charakteristiky migrace se mohou měnit, když se elektroforézované za různých podmínek pufru mohou vést k některým odchylkám, takže není vhodné pro přesné lokalizaci proteinů - ve většině případů však pásma na markeru nemusí být identické, a výsledky, které získáme, jsou stejně jako cílové proteiny. Ve většině případů však markerové pásy nemusí být úplně stejné jako náš cílový protein a to, co dostaneme, je pouze referenční velikost vzhledem k indikaci markeru a nakonec potřebujeme western, abychom jej charakterizovali, takže pokud nemusíme rozlišovat mezi pásma podobných velikostí, je stále velmi užitečný a také může být použity s untaitovaným proteinem.

Klasifikace předstiženého markeru proteinu

Předem obarvená proteinová marker je rozdělen do: monochromatického předem obarveného a vícebarevného předem obarveného, ​​monochromatického předem obarveného proteinového markeru, obvykle použije některé z pásů ke zdvojnásobení koncentrace určitých pásů, aby prohloubila tloušťka určitých pásů, aby naznačovala velikost jejich velikosti, takže si můžeme rychle zapamatovat a rozlišit mezi velikostí jednotlivých pásů. Barevné proteinové markery se rozlišují různými barvami, což je ještě rozpoznatelné. Navíc, pokud barevný duhový značka vyjde v tupém experimentu s elektroforézou, nálada bude v tuto chvíli šťastnější!

Kromě výše uvedeného existují i ​​jiné typy proteinových markerů na trhu: fluorescenční proteinové markery, biotinylované markery, vyvinuté proteinové markery atd. ....

Kromě toho jsou proteinové markery kategorizovány do vysoké molekulové hmotnosti, nízké molekulové hmotnosti a široké molekulové hmotnosti podle rozmezí molekulové hmotnosti. Markery s vysokou molekulovou hmotností se často používají pro proteiny s velkou molekulovou hmotností, zatímco markery rozsahu s malými molekulovou hmotností se často používají pro malé proteiny nebo dokonce nějaké peptidy. Pokud uvažujete o celé laboratoři, zvolte široké markery molekulové hmotnosti s rovnoměrnějším distribucí pásma, takže vaše proteiny lze snadno posoudit bez ohledu na to, ve kterém intervalu jsou.

Některé problémy se značkou

• Musí být všechny značky dojdou?

Například příručka pro instrukce uvádí 7 pásů, ve skutečnosti je normální dobíhat 6 pásů, může to být, že doba běhu nestačí, pokud váš protein není příliš malý, můžete čekat na bromofenolovou modrou frontu, aby před vypínáním elektroforézního přístroje, abyste měli mít 7 pásů. Někdy bude 5 pásů, ale pokud mohou být horní a spodní dva pásy vašeho cílového proteinu dojdou, nemusí to být 7 pásů.

• Co mám dělat, když se značka změní na smajlík?

Za prvé, gel není stisknut

Za druhé, plynulost lepidla na okraji desky a střed lepidla může být odlišná, neexistuje způsob, jak to udělat, s viskozitou a povrchovým napětím. Pokud řada metod nemůže vyřešit výše uvedený jev, výrobce osobních poradenství, aby změnil kanál na vzorku, vyberte jízdní pruh poblíž středu plaveckého pruhu, abyste spustili běh.

Efekt hrany, na okraji dvou pruhů vzorku, bude takto. Můžete zkusit pomalejší rychlost elektroforézy ......

Buď lepidlo není dobře stisknuto, když je připraveno, lepidlo není dobře připravené, nebo elektroforézní napětí je příliš vysoké, elektroosmotická síla je silná, nebo skleněná deska není během elektroforézy dobře sevřena a vnitřní elektroforézní roztok uniká, prosím, jeden po druhém.

• Jak vyřešit problém rozšiřování markerových pásů?

Příčina 1: Objem vzorku je příliš mnoho, objem vzorku by měl být snížen.

Protiopatření: Objem vzorku by měl být flexibilně kontrolován podle koncentrace vzorku a tloušťky gelu. Obecně je objem vzorku 10-15 μl (tj. 2-10 μg proteinu). Pokud je vzorek velmi zředěný, může objem vzorku dosáhnout 100 μl.

Příčina 2: neúplné rozpuštění vzorku.

Protiopatření:

(1) Vzorek by měl být plně rozpuštěn: Uchovávejte všechny druhy vzorků proteinů a markeru mohou být před odběrem vzorkování plně rozpuštěny, je lepší odstřelit vzorek před odběrem vzorkování a odstranit částice, které nelze rozpustit.

(2) roztok rozpuštění vzorku lze přidat podle požadavků proteinových souprav pro standardy molekulové hmotnosti; Pokud jsou standardní a neznámé vzorky nakonfigurovány, sledujte roztok rozpuštění vzorku 0,5-1,0 mg/l. Po rozpuštění přeneste ji do trubice EP, nasaďte čepici (můžete přidat klip na uzávěrku) a poté jej zahřát ve vodní lázni při 110 stupních Celsia na 3 minuty (můžete vyvrtat několik kulatých otvorů stejným průměrem, jako je ep trubice, a pak je vystavena nejvíce tiskové destičce, která je vystavena většině, která je vystavena tenčí tis Tělo trubice EP, ve vroucí vodní lázni a tenká polystyrenová deska se přirozeně vznáší ve vroucí vodní lázni.

Šarží trubek EP může být umístěna do vroucí vodní lázeň po dobu různých časů. (Nevhazujte zkumavky EP do vroucí vodní lázně, víčka mohou být odplavena) a poté pro použití při pokojové teplotě vychladnout při pokojové teplotě. Pokud se vzorek nepoužívá po delší dobu, uložte vzorek do chladničky při -20 stupňů Celsia a v případě potřeby zahřejte vzorek ve vroucí vodě při 110 stupních Celsia po 3 minuty při teplotě místnosti a ochlaďte jej před použitím pro použití a poté aplikujte vzorek, aby se odstranily narušitelné agregace ve vzorkových proteinech.

(3) Změňte roztok vyrovnávací paměti vzorku tak, aby vzorek mohl být plně rozpuštěn a množství SDS by mělo stačit.

Důvod: SDS pásy jsou elektroforeticky spojeny se sousedními proteiny. Kromě nadměrného vzorkování a neúplného rozpuštění vzorku může únik vzorkových jamek gelu způsobit, že se elektroforetické pásy rozšíří. Únik je často způsoben trhlinami mezi gelem a skleněnou deskou. Protiopatření: V tuto chvíli lze gel znovu připravit, hřeben by měl být opatrný, když je dokončena soudržnost gelu, rychlost by neměla být příliš rychlá, směr tažení by měl být kolmý k povrchu gelu; Aby se zabránilo trhlinám mezi skleněnou deskou na obou stranách gelu a gelem, nevytvářejte skleněnou desku na obou stranách gelu v procesu přípravy gelu.