Definición y uso del marcador de proteínas
El marcador de proteínas es una mezcla de proteínas de peso molecular conocido, que se usa como una 'regla ' para indicar el tamaño de las bandas de proteínas.
En el proceso de transferencia Western, el marcador de peso molecular es como un tornillo, aunque es un enlace pequeño, sin embargo, es un detalle tan pequeño el que tiene un efecto significativo en los resultados experimentales. El papel del marcador se usa principalmente para indicar el peso molecular de las bandas de proteínas correspondientes al tamaño del peso molecular, y solo si la cantidad estándar estándar y correctas y correctas, los resultados de los experimentos son convincentes, se convierten en el peso de la proteín, también muestran el peso de la proteína, también muestran el peso de la proteína, también muestran el peso de la proteína, los resultados, los resultados, los resultados, los resultados, los resultados, los resultados, los resultados, los resultados, los resultados, los que se convierten en la adición, también muestran que el peso es convincente. La membrana se transfecta o no. Además, también muestra si la transferencia de membrana es exitosa o no, y el grado de electroforesis de la proteína en el gel, etc. Por lo tanto, elegir el marcador de proteína correcto también es una de las condiciones necesarias para el éxito de los experimentos de transferencia Western.
Clasificación de marcadores de proteínas
En general, los marcadores de proteínas más utilizados se clasifican en marcadores de proteínas no teñidos y marcadores de proteínas prefabricados.
Es una premezcla de varias proteínas de peso molecular conocido y purificado, lo cual es conveniente para la comparación de proteínas de diferentes tamaños. El marcador no manchado de pre-previo no es tan bueno como el marcador prefabricado porque es completamente invisible durante la electroforesis, y solo puede indicarse después de la tinción de proteínas al final de la electroforesis, y no puede usarse como referencia en el proceso experimental, que pertenece al tipo de 'Hindsight '. Sin embargo, dado que la proteína no está acompañada de una molécula de colorante o una molécula de marcador, el tamaño que se muestra es exactamente el tamaño original de la proteína, por lo que es más preciso y puede determinar con precisión el tamaño de la proteína.
El marcador premezclado generalmente tiene algunas bandas duplicando la concentración como una indicación, porque cuantas más bandas sean mixtas, peor es recordar, quién sabe cuál es esa! Es difícil contar hasta que tus ojos estén borrosos. Entonces, cuando vea los particularmente concentrados, las bandas de marcadores recordarán dónde están. Sin embargo, recuerde, las bandas más pequeñas generalmente no son tan fáciles de ver. En términos de selección, por supuesto, es mejor elegir al menos una de las bandas que es similar en tamaño a su proteína objetivo, más cerca, mejor.
El marcador de proteínas prefabricado es algunas proteínas purificadas mezcladas juntas por acoplamiento covalente con un colorante, que se puede observar directamente durante la electroforesis o la transferencia de membrana.
Los marcadores de proteínas precipitados son convenientes para nuestros experimentos. Este estándar de peso molecular de proteína puede ayudarnos a monitorear la electroforesis y estimar la movilidad durante y después de la electroforesis, así como después de la transferencia de membrana, por ejemplo, por ejemplo, si se sabe que la zona óptima de resolución para la electroforesis vertical es aproximadamente 2/3 del camino a través del gel, utilizando un marcador pre -manchado, es posible, por ejemplo, se sabe que la zona de resolución óptima de la electrofores vertical de la electrofores vertical es aproximadamente 2/3, es posible que se trata de la zona optimal de la electrofores vertical de la electrofores vertical, se trata de la gel de la gelis, se sabe que la zona óptima de la zona vertical de la electrofores vertical es aproximadamente 2/3, es posible que se trata de la zona optimal de la electrofores vertical de la electrofores vertical, es aproximadamente 2/3, se sabe que la zona óptima de la zona vertical de la electrofores vertical es aproximadamente el 2 Use un marcador prefabricado, puede predecir cuándo la proteína objetivo ingresa a la zona de resolución óptima y detener la electroforesis para obtener el efecto de resolución óptimo; También puede terminar la electroforesis a tiempo si observa una anormalidad en la electroforesis del marcador; Además, puede observar si la proteína se transfiere completamente a la membrana después de la transferencia de membrana en la transferencia Western y puede etiquetar el peso molecular de la proteína en la membrana, por lo que atrae a muchos laboratorios para comprar el estándar de proteína prefabricado.
Vale la pena señalar que el marcador de proteínas previamente teñido se combina covalentemente con el tinte, por lo que las características de migración pueden cambiar cuando electroforesis en diferentes condiciones de tampón, lo que puede conducir a algunas desviaciones, por lo que no es adecuada para la localización precisa de las proteínas, sin embargo, en la mayoría de los casos, las bandas en el marcador pueden no ser idénticas a la proteína objetivo, y los resultados son los mismos que obtenemos los mismos, los mismos, los mismos, lo mismo, lo mismo, lo mismo, ya que los mismos, los mismos, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, los mismos, lo mismo, lo mismo, ya que los mismos, los mismos, los mismos, los mismos, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, lo mismo, ya que los mismos son los mismos. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las bandas de marcadores pueden no ser exactamente las mismas que nuestra proteína objetivo, y lo que obtenemos es solo un tamaño de referencia en relación con la indicación del marcador, y al final, necesitamos occidental para caracterizarla, por lo que si no necesitamos distinguir entre bandas de tamaños similares, el marcador precipitado sigue siendo muy útil, y también se puede utilizar junto con el estándar de proteína sinstanías.
Clasificación del marcador de proteínas previsado
El marcador de proteínas previamente teñido se divide en: un marcador de proteína prefabricado monocromático monocromo y multicolor. Los marcadores de proteínas de color se distinguen por diferentes colores, que es aún más reconocible. Además, si un marcador de arco iris colorido sale en un experimento de electroforesis opaco, ¡el estado de ánimo será más feliz en este momento!
Además de lo anterior, hay algunos otros tipos de marcadores de proteínas en el mercado: marcadores de proteínas fluorescentes, marcadores biotinilados, marcadores de proteínas desarrollados, etc. ....
Además, los marcadores de proteínas se clasifican en alto peso molecular, bajo peso molecular y peso molecular ancho según el rango de peso molecular. Los marcadores de rango de peso molecular alto a menudo se usan para proteínas de peso molecular grande, mientras que los marcadores de rango de peso molecular pequeño a menudo se usan para proteínas pequeñas o incluso algunos péptidos. Si considera todo el laboratorio, elija marcadores de peso molecular amplios con una distribución de banda más uniforme, para que sus proteínas puedan juzgar fácilmente sin importar en qué intervalo se encuentren.
Algunos problemas con el marcador
Por ejemplo, el manual de instrucciones enumera 7 bandas, de hecho, es normal agotarse 6 bandas, puede ser que el tiempo de ejecución no sea suficiente, si su proteína no es muy pequeña, puede esperar a que el frente azul de bromofenol se agote el gel antes de apagar el aparato de electroforesis, para que pueda poder tener 7 bandas. A veces habrá 5 bandas, pero mientras las dos bandas superior e inferior de su proteína objetivo se puedan agotarse, no tiene que ser 7 bandas.
Primero, el gel no está presionado
En segundo lugar, la fluidez del pegamento en el borde de la placa y el centro del pegamento puede ser diferente, no hay forma de hacer esto, con la viscosidad y la tensión superficial. Si una variedad de métodos no puede resolver el fenómeno anterior, el fabricante de consejos personales para cambiar un canal en la muestra, elija un carril cerca del centro del carril de natación para ejecutar una carrera.
El efecto de borde, en el borde de los dos carriles de la muestra, será así. Puede probar la velocidad de electroforesis más lenta ...
O el pegamento no está bien presionado cuando está preparado, el pegamento no está bien preparado, o el voltaje de electroforesis es demasiado alto, la fuerza electroosmótica es fuerte o la placa de vidrio no está bien sujetada durante la electroforesis, y la solución de electroforesis interna está goteando, verifíquela una por una.
Causa 1: El volumen de muestra es demasiado, el volumen de muestra debe reducirse.
Contramedición: el volumen de la muestra debe controlarse de manera flexible de acuerdo con la concentración de la muestra y el grosor del gel. En general, el volumen de la muestra es de 10-15 μl (es decir, 2-10 μg de proteína). Si la muestra está muy diluida, el volumen de la muestra puede alcanzar 100 μl.
Causa 2: disolución incompleta de la muestra.
Contramedidas:
(1) La muestra debe disolverse completamente: mantenga todo tipo de muestras de proteínas y el marcador se pueden disolver completamente antes del muestreo, es mejor centrifugarse la muestra antes del muestreo, y eliminar las partículas que no se pueden disolver.
(2) la solución de disolución de la muestra se puede agregar de acuerdo con los requisitos de los kits de proteínas para los estándares de peso molecular; Si las muestras estándar y desconocidas se autoconfiguran, siga 0.5-1.0 mg/L de solución de disolución de muestra. Después de la disolución, transfiéralo al tubo EP, coloque la tapa (puede agregar un clip a la tapa) y luego calentarlo en un baño de agua a 110 grados Celsius durante 3 minutos (puede perforar varios agujeros redondos con el mismo diámetro que el tubo EP en la placa delgada de espolachos, y el tubo EP se coloca hasta que el borde de la tapa está restringido de la caída más hacia abajo, y luego coloca la placa delgada de estiramiento delgada. Tubo, en el baño de agua hirviendo y la delgada placa de espuma de poliestireno flota naturalmente en el baño de agua hirviendo.
Se puede colocar un lote de tubos EP en el baño de agua hirviendo durante diferentes momentos. (No arroje los tubos EP al baño de agua hirviendo, las tapas se pueden lavar) y luego enfriar a temperatura ambiente para su uso. Si la muestra no se usa durante un período de tiempo más largo, almacene la muestra en un refrigerador a -20 grados centígrados, y cuando sea necesario, calienta la muestra en agua hirviendo a 110 grados centígrados durante 3 minutos a temperatura ambiente y enfríe antes de quitarla para usarlo y luego aplicar la muestra para eliminar los agregados sustables en las proteínas de la muestra.
(3) Cambie la solución de tampón de muestra para que la muestra pueda disolverse completamente y la cantidad de SDS debe ser suficiente.
Razón: las bandas SDS están vinculadas electroforéticamente a las proteínas vecinas. Además de la exhibición excesiva y la disolución incompleta de la muestra, la fuga de los pozos de muestra del gel puede hacer que las bandas electroforéticas se amplíen. La fuga a menudo es causada por grietas entre el gel y la placa de vidrio. Contramedidas: en este momento, el gel solo se puede volver a preparar, el peine debe tener cuidado al tirar de la cohesión del gel, la velocidad no debe ser demasiado rápida, la dirección de tirar hacia arriba debe ser perpendicular a la superficie del gel; Para evitar grietas entre la placa de vidrio en ambos lados del gel y el gel, no apriete la placa de vidrio en ambos lados del gel en el proceso de preparación del gel.
