Definición y uso del marcador de proteínas
El marcador de proteínas es una mezcla de proteínas de peso molecular conocido, que se utiliza como una 'regla' para indicar el tamaño de las bandas de proteínas.
En el proceso de Western Blot, el marcador de peso molecular es como un tornillo, aunque es un pequeño eslabón, sin embargo, es un detalle tan pequeño que tiene un efecto significativo en los resultados experimentales. El papel del marcador se utiliza principalmente para indicar el peso molecular de las bandas de proteínas correspondientes al tamaño del peso molecular, y sólo si la cantidad estándar es precisa y correcta, los resultados de los experimentos son convincentes, además del marcador de proteínas también muestra si la membrana está transfectada o no. Además, también muestra si la transferencia de membrana es exitosa o no, y el grado de electroforesis de la proteína en el gel, etc. Por lo tanto, elegir el marcador de proteína correcto es también una de las condiciones necesarias para el éxito de los experimentos de Western Blot.
Clasificación de marcadores de proteínas.
En general, los marcadores de proteínas más utilizados se clasifican en marcadores de proteínas no teñidos previamente y marcadores de proteínas preteñidos.
Es una premezcla de varias proteínas de peso molecular conocido y purificadas, lo que resulta conveniente para la comparación de proteínas de diferentes tamaños. El marcador no teñido previamente no es tan bueno como el marcador teñido previamente porque es completamente invisible durante la electroforesis y solo puede indicarse después de la tinción de proteínas al final de la electroforesis y no puede usarse como referencia en el proceso experimental, que pertenece al tipo de 'retrospectiva'. Sin embargo, dado que la proteína no va acompañada de una molécula de colorante o una molécula marcadora, el tamaño mostrado es exactamente el tamaño original de la proteína, por lo que es más preciso y puede determinar con precisión el tamaño de la proteína.
El marcador premezclado suele tener unas pocas bandas que duplican la concentración a modo indicativo, porque cuantas más bandas se mezclan, peor es para recordar, ¡quién sabe cuál es esa! Es difícil contar hasta que tus ojos se vuelven borrosos. Así, cuando veas los que están particularmente concentrados, las bandas marcadoras recordarán dónde están. Sin embargo, recuerde que las bandas más pequeñas no suelen ser tan fáciles de ver. En términos de selección, por supuesto, lo mejor es elegir al menos una de las bandas que sea similar en tamaño a la proteína objetivo; cuanto más cerca, mejor.
El marcador de proteínas preteñido son algunas proteínas purificadas mezcladas mediante acoplamiento covalente con un tinte, que se pueden observar directamente durante la electroforesis o la transferencia de membrana.
Los marcadores de proteínas preteñidos son convenientes para nuestros experimentos. Este estándar de peso molecular de proteínas puede ayudarnos a monitorear la electroforesis y estimar la movilidad durante y después de la electroforesis, así como después de la transferencia de membrana; por ejemplo, si se sabe que la zona de resolución óptima para la electroforesis vertical es aproximadamente 2/3 del camino a través del gel, usando un marcador preteñido es posible. Por ejemplo, se sabe que la zona de resolución óptima de la electroforesis vertical es aproximadamente 2/3 del gel; si usa un marcador preteñido, puede predecir cuándo se alcanzará el objetivo la proteína ingresa a la zona de resolución óptima y detiene la electroforesis para obtener el efecto de resolución óptima; también puede finalizar la electroforesis a tiempo si observa una anomalía en la electroforesis del Marcador; Además, se puede observar si la proteína se transfiere completamente a la membrana después de la transferencia de la membrana en el Western Blot y se puede etiquetar el peso molecular de la proteína en la membrana, lo que atrae a muchos laboratorios a comprar el estándar de proteína preteñido.
Vale la pena señalar que el marcador de proteína preteñido está acoplado covalentemente con el tinte, por lo que las características de migración pueden cambiar cuando se realiza la electroforesis en diferentes condiciones de tampón, lo que puede provocar algunas desviaciones, por lo que no es adecuado para la localización precisa de proteínas; sin embargo, en la mayoría de los casos, las bandas en el marcador pueden no ser idénticas a la proteína objetivo y los resultados que obtenemos son los mismos que los de la proteína objetivo. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las bandas del Marcador pueden no ser exactamente las mismas que nuestra proteína objetivo, y lo que obtenemos es solo un tamaño de referencia en relación con la indicación del Marcador y, al final, necesitamos Western para caracterizarlo, por lo que si no necesitamos distinguir entre bandas de tamaños similares, el Marcador preteñido sigue siendo muy útil y también se puede usar junto con el estándar de proteína sin teñir.
Clasificación del marcador de proteína preteñido
El marcador de proteína preteñido se divide en: preteñido monocromático y preteñido multicolor, el marcador de proteína monocromático preteñido generalmente usará algunas de las bandas para duplicar la concentración de ciertas bandas para profundizar el grosor de ciertas bandas y sugerir el tamaño de su tamaño, de modo que podamos memorizar y diferenciar rápidamente entre el tamaño de las bandas individuales. Los marcadores de proteínas de color se distinguen por diferentes colores, lo que los hace aún más reconocibles. Además, si aparece un marcador de arco iris de colores en un aburrido experimento de electroforesis, ¡el estado de ánimo será más feliz en ese momento!
Además de los anteriores, existen en el mercado otros tipos de Marcadores proteicos: Marcadores proteicos fluorescentes, Marcadores biotinilados, Marcadores proteicos desarrollados, etc....
Además, los marcadores de proteínas se clasifican en peso molecular alto, peso molecular bajo y peso molecular amplio según el rango de peso molecular. Los marcadores de rango de peso molecular alto se usan a menudo para proteínas de peso molecular grande, mientras que los marcadores de rango de peso molecular pequeño se usan a menudo para proteínas pequeñas o incluso algunos péptidos. Si considera todo el laboratorio, elija marcadores de peso molecular amplio con una distribución de bandas más uniforme, para que sus proteínas puedan juzgarse fácilmente sin importar en qué intervalo se encuentren.
Algunos problemas con el marcador
Por ejemplo, el manual de instrucciones enumera 7 bandas, de hecho, es normal que se acaben 6 bandas, puede ser que el tiempo de ejecución no sea suficiente, si tu proteína no es muy pequeña, puedes esperar a que se acabe el frente azul de bromofenol del gel antes de apagar el aparato de electroforesis, así deberías poder tener 7 bandas. A veces habrá 5 bandas, pero siempre que las dos bandas superior e inferior de la proteína objetivo se puedan agotar, no es necesario que sean 7 bandas.
Primero, el gel no se presiona.
En segundo lugar, la fluidez del pegamento en el borde de la placa y en el centro del pegamento puede ser diferente, no hay forma de hacerlo, con la viscosidad y la tensión superficial. Si una variedad de métodos no pueden resolver el fenómeno anterior, el creador de consejos personales debe cambiar un canal en la muestra y elegir un carril cerca del centro del carril de natación para correr.
El efecto de borde, en el borde de los dos carriles de la muestra será así. Puedes probar una velocidad de electroforesis más lenta...
O el pegamento no está bien prensado cuando se prepara, el pegamento no está bien preparado, o el voltaje de electroforesis es demasiado alto, la fuerza electroosmótica es fuerte o la placa de vidrio no está bien sujeta durante la electroforesis y la solución de electroforesis interna tiene fugas, revíselos uno por uno.
Causa 1: El volumen de muestra es demasiado, se debe reducir el volumen de muestra.
Contramedida: El volumen de la muestra debe controlarse de manera flexible de acuerdo con la concentración de la muestra y el espesor del gel. Generalmente, el volumen de muestra es de 10 a 15 μl (es decir, de 2 a 10 μg de proteína). Si la muestra está muy diluida, el volumen de la muestra puede alcanzar los 100 μl.
Causa 2: Disolución incompleta de la muestra.
Contramedidas:
(1) La muestra debe estar completamente disuelta: conserve todo tipo de muestras de proteínas y el marcador se puede disolver completamente antes del muestreo; es mejor centrifugar la muestra antes del muestreo y eliminar las partículas que no se pueden disolver.
(2) La solución de disolución de muestras se puede agregar de acuerdo con los requisitos de los kits de proteínas para los estándares de peso molecular; Si las muestras estándar y desconocida están autoconfiguradas, siga una solución de disolución de muestra de 0,5 a 1,0 mg/l. Después de la disolución, transfiéralo al tubo de Ep, coloque la tapa (puede agregar un clip en la tapa) y luego caliéntelo en un baño de agua a 110 grados Celsius durante 3 minutos (puede perforar varios orificios redondos con el mismo diámetro que el tubo de Ep en la placa delgada de espuma de poliestireno, y el tubo de Ep se coloca hasta que el borde de la tapa no pueda bajar más, y luego coloque la placa delgada de espuma de poliestireno, que está exponiendo la mayor parte del cuerpo del Ep tubo, en el baño de agua hirviendo, y la fina placa de poliestireno flota naturalmente en el baño de agua hirviendo. La fina lámina de poliestireno flota naturalmente en la superficie del agua hirviendo, facilitando el acceso y el calentamiento, y evitando salpicaduras del agua hirviendo.
Se puede colocar un lote de tubos Ep en el baño de agua hirviendo durante diferentes momentos. (No arroje los tubos de Ep al baño de agua hirviendo, las tapas pueden lavarse) y luego enfríelos a temperatura ambiente para su uso. Si la muestra no se utiliza durante un período de tiempo más largo, guárdela en un refrigerador a -20 grados Celsius y, cuando sea necesario, caliente la muestra en agua hirviendo a 110 grados Celsius durante 3 minutos a temperatura ambiente y enfríela antes de retirarla para su uso y luego aplicar la muestra para eliminar los agregados subestables en las proteínas de la muestra.
(3) Cambie la solución tampón de la muestra para que la muestra pueda disolverse completamente y la cantidad de SDS sea suficiente.
Motivo: las bandas de SDS están unidas electroforéticamente a proteínas vecinas. Además del sobremuestreo y la disolución incompleta de la muestra, las fugas de los pocillos de muestra del gel pueden hacer que las bandas electroforéticas se ensanchen. La fuga suele deberse a grietas entre el gel y la placa de vidrio. Contramedidas: en este momento, el gel solo se puede volver a preparar, el peine debe tener cuidado cuando se completa la cohesión del gel, la velocidad no debe ser demasiado rápida, la dirección de extracción debe ser perpendicular a la superficie del gel; Para evitar grietas entre la placa de vidrio de ambos lados del gel y el gel, no apriete la placa de vidrio de ambos lados del gel durante el proceso de preparación del gel.
