Marker białka | Jak wybrać | Analiza problemu

Definicja markera białka i użycie

Marker białkowy jest mieszaniną białek o znanej masie cząsteczkowej, która jest stosowana jako „linijka ”, wskazując wielkość pasm białkowych.

W procesie Western blot marker masy cząsteczkowej jest jak śruba, chociaż jest to niewielki ogniwo, jest to jednak taki mały szczegół, który ma znaczący wpływ na wyniki eksperymentalne. Rola markera jest używana głównie do wskazania, że ​​masa cząsteczkowa pasm białkowych odpowiadają wielkościom wielkości wielkości cząsteczki, a tylko wtedy, gdy standardowa ilość dokładności i prawidłowej, wyniki eksperymentów są zgodne z tym, że jest to, że jest to, że jest to, że jest to, że jest to, że to jest to, że jest to, że jest to, że zależnie od tego, że zależą to od tego, że zależą to od tego, że zależą to od tego, że zależą to od tego, że zależą to od tego, że zależą to od tego, że zależą to od tego, że wyniki są również zgodne z tym, że wyniki są zgodne z tym, że są również zgodne z tym, że wyniki są zgodne z zależnymi od składu. Membrana jest transfekowana lub nie. Ponadto pokazuje również, czy transfer membrany zakończy się powodzeniem, czy nie, a stopień elektroforezy białka na żelu itp. Dlatego wybór odpowiedniego markera białka jest również jednym z niezbędnych warunków do powodzenia eksperymentów Western blot.

Klasyfikacja markerów białkowych

Zasadniczo najczęściej stosowane markery białkowe są podzielone na niepReatwy markerów białkowych i markerów białkowych.

• Nieprebowany marker białkowy

Jest to premia kilku białek o znanej masie cząsteczkowej i oczyszczona, co jest wygodne do porównania białek o różnych rozmiarach. Marker niewidoczny nie jest tak dobry jak marker wstępnie barwiony, ponieważ jest całkowicie niewidoczny podczas elektroforezy i można go wskazać tylko po barwieniu białka na końcu elektroforezy i nie można go wykorzystać jako odniesienia w procesie eksperymentalnym, który należy do rodzaju „perfutacji ”. Ponieważ jednak białkowi nie towarzyszy cząsteczka barwnika lub cząsteczka markera, pokazany rozmiar jest dokładnie pierwotnym rozmiarem białka, więc jest dokładniejszy i może dokładnie określić rozmiar białka.

Zamieszkany marker zwykle ma kilka pasm podwajających koncentrację jako wskazówkę, ponieważ im więcej pasm jest mieszane, tym gorzej należy pamiętać, kto wie, który z nich jest ten! Trudno się liczyć, dopóki twoje oczy nie zostaną zamazane. Więc kiedy zobaczysz szczególnie skoncentrowane, pasma markerów zapamiętają, gdzie są. Pamiętaj jednak, że mniejsze opaski zwykle nie są tak łatwe do zobaczenia. Jeśli chodzi o selekcję, oczywiście najlepiej wybrać co najmniej jeden z pasm podobnych do białka docelowego, tym lepiej.

• Wstępny marker białka

Zamorowany markerem białka to niektóre oczyszczone białka zmieszane przez kowalencyjne sprzężenie z barwnikiem, które można bezpośrednio zaobserwować podczas transferu elektroforezy lub błony.

Wstępnie poplamione markery białkowe są wygodne dla naszych eksperymentów. Ten standard masy cząsteczkowej białka może pomóc nam monitorować elektroforeza i oszacować ruchliwość podczas i po elektroforezie, a także po przeniesieniu błony - na przykład, jeśli wiadomo, że optymalna strefa rozdzielczości elektroforezy pionowej wynosi około 2/3 drogi przez żel, za pomocą wstępnie zabarwionego markera, można na przykład, można było na przykład strefować elektropę w pionie 2/3. Użyj markera wstępnie poplamionego, możesz przewidzieć, kiedy białko docelowe wchodzi w optymalną strefę rozdzielczości i zatrzymać elektroforeza w celu uzyskania optymalnego efektu rozdzielczości; Możesz również zakończyć elektroforeza w czasie, jeśli zaobserwujesz nieprawidłowość w elektroforezy markera; Ponadto można zauważyć, czy białko jest całkowicie przenoszone na błonę po przeniesieniu błony w Western blot i można oznaczyć masę cząsteczkową białka na błonie, dlatego przyciąga wiele laboratoriów, aby kupić wstępnie poplamiony standard białka.

Warto zauważyć, że wstępnie poplamiony marker białka jest kowalencyjnie sprzężony z barwnikiem, więc charakterystyka migracji może się zmieniać, gdy elektroforesowanie w różnych warunkach buforowych, co może prowadzić do niektórych odchyleń, więc nie są odpowiednie dla precyzyjnej lokalizacji białek - jednak w większości przypadków, pasma na markerie mogą nie być identyczne z białkiem docelowym, a wyniki są tak samo, jak docelowe białka. Jednak w większości przypadków pasma markerów mogą nie być dokładnie takie same jak nasze białko docelowe, a to, co otrzymujemy, jest po prostu rozmiarem odniesienia w stosunku do wskazania markera, a ostatecznie potrzebujemy zachodniego, aby go scharakteryzować, więc jeśli nie musimy rozróżniać między pasmami o podobnych rozmiarach, marker zapęszony jest nadal bardzo przydatny, a może być również używany we współpracy z niestosowanym białkiem.

Klasyfikacja prestialnego markera białka

Zamorowany marker białkowy jest podzielony na: monochromatyczne preparowane i wielokolorowe preparowane, monochromatyczne marker białka przed poplamionym, zwykle wykorzysta niektóre pasma, aby podwoić stężenie niektórych pasm w celu pogłębienia grubości niektórych pasm, aby zasugerować wielkość ich wielkości, dzięki czemu możemy szybko zapamiętać i rozróżniać między rozmiarami poszczególnych pasm. Markery białkowe kolorów wyróżniają się różnymi kolorami, co jest jeszcze bardziej rozpoznawalne. Co więcej, jeśli kolorowy marker tęczy pojawi się w matowym eksperymencie elektroforezy, nastrój będzie w tej chwili szczęśliwszy!

Oprócz powyższego na rynku znajdują się inne rodzaje markerów białkowych: fluorescencyjne markery białkowe, markery biotynylowane, rozwinięte markery białkowe itp.

Ponadto markery białkowe są podzielone na wysoką masę cząsteczkową, niską masę cząsteczkową i szeroką masę cząsteczkową w zależności od zakresu masy cząsteczkowej. Markery o wysokiej masie cząsteczkowej są często stosowane do białek o dużej masie cząsteczkowej, podczas gdy markery masy małej cząsteczkowej są często stosowane do małych białek lub nawet niektórych peptydów. Jeśli weźmiesz pod uwagę całe laboratorium, wybierz szerokie markery masy cząsteczkowej z bardziej jednolitym rozkładem pasm, aby można było łatwo ocenić białka bez względu na to, w jakim przedziale są.

Niektóre problemy z markerem

• Czy wszystkie znaczniki muszą się skończyć?

Na przykład instrukcja obsługi wymienia 7 pasm, w rzeczywistości normalne jest wyczerpanie 6 pasm, być może czas działania nie wystarczy, jeśli twoje białko nie jest zbyt małe, możesz poczekać, aż front niebieski bromofenolu wybierze się z żelu, zanim wyłączysz aparat elektroforezy, tak że powinieneś mieć 7 pasm. Czasami będzie 5 pasm, ale dopóki górne i dolne dwa pasma docelowego białka można się skończyć, nie musi to być 7 pasm.

• Co powinienem zrobić, jeśli znacznik zamienia się w buźkę?

Po pierwsze, żel nie jest wciśnięty

Po drugie, płynność kleju na krawędzi płyty i środek kleju może być inna, nie ma sposobu, aby to zrobić, z lepkością i napięciem powierzchniowym. Jeśli różnorodne metody nie mogą rozwiązać powyższego zjawiska, osobistego producenta porad, aby zmienić kanał na próbce, wybierz linię w pobliżu środka ścieżki pływackiej, aby uruchomić.

Będzie taki efekt krawędzi, na skraju dwóch pasów próbki. Możesz spróbować wolniejszej prędkości elektroforezy ......

Albo klej nie jest dobrze prasowany, gdy jest przygotowywany, klej nie jest dobrze przygotowany, albo napięcie elektroforezy jest zbyt wysokie, siła elektroosmotyczna jest silna, lub szklana płyta nie jest dobrze zaciśnięta podczas elektroforezy, a wewnętrzny roztwór elektroforezy jest przeciekający.

• Jak rozwiązać problem poszerzenia pasm markerów?

Przyczyna 1: Objętość próbki jest zbyt duża, objętość próbki należy zmniejszyć.

Zakład środowiska: Objętość próbki należy elastycznie kontrolować zgodnie z stężeniem próbki i grubości żelu. Zasadniczo objętość próbki wynosi 10-15 μl (tj. 2-10 μg białka). Jeśli próbka jest bardzo rozcieńczona, objętość próbki może osiągnąć 100 μl.

Przyczyna 2: Niekompletne rozwiązanie próbki.

Środki zaradcze:

(1) Próbka powinna zostać w pełni rozpuszczona: Zachowaj wszelkiego rodzaju próbki białka, a marker można w pełni rozpuścić przed pobieraniem próbek, lepiej jest odwirować próbkę przed pobieraniem próbek i usunąć cząstki, których nie można rozpuścić.

(2) roztwór rozpuszczania próbki można dodać zgodnie z wymaganiami zestawów białkowych dla standardów masy cząsteczkowej; Jeśli standardowe i nieznane próbki są samokonfigurowane, postępuj zgodnie z roztworem rozpuszczania próbki 0,5-1,0 mg/l. Po rozpuszczeniu przenieś go do rurki EP, załóż nasadkę (możesz dodać klips na czapce), a następnie podgrzej go do łaźni wodnej w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez 3 minuty (możesz wywiercić kilka okrągłych otworów o tej samej średnicy, jak rurka EP w cienkiej płytce styczoamowej, a rurka EP jest odkładana, aż krawędź nasadki zostanie ograniczona od krawędzi kapitalizacji Rurka w wrzącej kąpieli wodnej i cienka płyta styropianowa unosi się naturalnie w wrzącej kąpieli wodnej.

Partię rur EP można umieścić w wrzącej kąpieli wodnej w różnych czasach. (Nie wrzucaj rur EP do wrzącej wanny, pokrywki można zmyć), a następnie ostygnąć w temperaturze pokojowej w celu użycia. Jeśli próbka nie jest używana przez dłuższy czas, przechowuj próbkę w lodówce w temperaturze -20 stopni Celsjusza, a w razie potrzeby podgrzej próbkę w wrzącej wodzie przy 110 stopni Celsjusza przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ochłodzić ją przed usunięciem do użycia, a następnie nałóż próbkę, aby usunąć subtelne agregaty w próbkach.

(3) Zmień roztwór buforu próbki, aby próbka mogła zostać w pełni rozpuszczona, a ilość SDS powinna być wystarczająca.

Powód: pasma SDS są elektroforetycznie powiązane z sąsiednimi białkami. Oprócz nadmiernego próbkowania i niepełnego rozpuszczania próbki, wyciek studzienek próbek żelu może powodować rozszerzenie pasm elektroforetycznych. Wyciek jest często spowodowany pęknięciami między żelem a szklaną płytą. Zaradcze: W tej chwili żel można ponownie przygotować, grzebień powinien zachować ostrożność po zakończeniu kohezji żelu, prędkość nie powinna być zbyt szybka, kierunek podciągania powinien być prostopadły do ​​powierzchni żelu; Aby uniknąć pęknięć między szklaną płytą po obu stronach żelu i żelu, nie ściskać szklanej płyty po obu stronach żelu w procesie przygotowania żelu.