Ako zabrániť kontaminácii v bunkovej kultúre?

Tento článok predstavuje hlavne bežné typy kontaminácie buniek.

Pracovná oblasť:

1. Je ventilačný kryt pre bunkovú kultúru správne nastavený?

2. Existujú nejaké prúdy vzduchu alebo priame vstupné kanály v oblasti, kde sa nachádza ventilačný kryt bunkovej kultúry?

3. Je pracovný stôl čistý?

4. Boli na pracovný stôl umiestnené iba položky potrebné pre experiment?

5. 
   

6. Vytreli ste pracovný stôl pred začatím práce 70 % etanolom?

7. Čistíte a dezinfikujete pravidelne inkubátor, chladničku, mrazničku a ďalšie laboratórne vybavenie?

Osobná hygiena:

1. Umyli ste si ruky?

2. Nosili ste osobné ochranné prostriedky?

3. Ak máte dlhé vlasy, sú zopnuté?

4. Používate na manipuláciu s tekutinami pipetu?

5. Činidlá a kultivačné médiá

6. Sterilizovali ste všetky činidlá, médiá a roztoky pripravené v laboratóriu pomocou vhodných metód?

7. Pred umiestnením nádob, kultivačných fliaš, kultivačných tanierov a kultivačných misiek na pracovnú plochu ste utreli ich vonkajšok 70 % etanolom?

8. Utiahli ste viečka reagenčných fliaš, kultivačných fliaš a iných nádob, keď sa nepoužívajú?

9. Boli všetky kultivačné platne umiestnené v sterilných, vzduchotesných vreckách?

10. Existujú nejaké známky kontaminácie v reagentoch, ako je zákal, plávajúce častice, nepríjemný zápach alebo abnormálne farby? Ak áno, vyčistili ste ich alebo zlikvidovali?

Prevádzka:

1. Pracujete pomaly, opatrne a venujete pozornosť aseptickým technikám?

2. Vytreli ste povrch pipiet, reagenčných fliaš a kultivačných fliaš 70 % etanolom predtým, ako ste ich umiestnili do ventilačného krytu bunkovej kultúry?

3. Umiestnili ste viečka smerom nadol v pracovnej oblasti?

4. Používate na manipuláciu s tekutinami sterilné sklenené pipety alebo jednorazové sterilné plastové pipety?

5. Používate sterilné pipety iba raz, aby ste sa vyhli krížovej kontaminácii?

6. Nedotýkali ste sa špičkou pipety akýmkoľvek nesterilným predmetom vrátane vonkajšieho okraja závitov hrdla fľaše?

7. Ak dôjde k rozliatiu tekutiny, okamžite ste ju absorbovali a utreli ste oblasť 70% etanolom?

Treba poznamenať, že umiestnenie a usporiadanie predmetov na super čistej lavici, ako aj osobná hygiena, ako sú dlhé vlasy, sa dajú ľahko prehliadnuť. Príliš veľa predmetov na superčistej lavici môže spôsobiť rušenie prúdenia vzduchu a tlaku vzduchu, takže každý musí venovať pozornosť.

'Poznaj seba a svojho nepriateľa a nikdy nebudeš porazený v stovke bitiek.' Keď vieme, ako zabrániť kontaminácii, musíme ju vedieť aj identifikovať. Koniec koncov, kontaminované bunky musia byť okamžite zlikvidované, inak, ak kontaminanty pozbierajú všetky drahokamy, bude to...

Kontaminácia bunkovej kultúry sa delí hlavne na dve kategórie: chemické kontaminanty, ako sú nečistoty v kultivačnom médiu, sére a vode, endotoxíny, zmäkčovadlá a detergenty; a biologické kontaminanty, ako sú baktérie, huby, kvasinky, vírusy, mykoplazmy a krížová kontaminácia iných bunkových línií.

Bakteriálna kontaminácia:

Baktérie majú rôzne tvary, ako sú guľovité, tyčinkovité a špirálovité. Baktérie a huby spolu tvoria najčastejšie sa vyskytujúce biologické kontaminanty v bunkovej kultúre. Keď sú bunky kontaminované baktériami, často sa to dá zistiť v priebehu jedného alebo dvoch dní jednoduchým pozorovaním voľným okom a hodnota pH kultivačného média sa môže náhle znížiť. Obrázok nižšie ukazuje 293 buniek kontaminovaných E. coli a rastúcich ako adherentné bunky.

Plesňová kontaminácia:

V počiatočnom štádiu plesňovej kontaminácie zostáva pH kultivačného média stabilné, ale ako sa kontaminácia zhoršuje, pH sa rýchlo zvyšuje, čo spôsobuje zakalenie média. Pod mikroskopom sa hýfy často javia ako tenké zväzky a niekedy ako husté zhluky spór. Spóry znesú extrémne drsné a nepriaznivé prostredie počas vegetačného pokoja. Preto, keď dôjde k plesňovej kontaminácii, je potrebné bunky urýchlene zlikvidovať, aby sa zabránilo rozsiahlej kontaminácii v inkubátore.

Kvasinková kontaminácia:

Podobne ako pri bakteriálnej kontaminácii, kultivačné médium sa zakalí, keď je kontaminované kvasinkami, najmä v neskoršom štádiu kontaminácie. pH kultivačného média sa po kontaminácii kvasinkami mení len veľmi málo a zvyšuje sa len vtedy, keď je kontaminácia silná. Pod mikroskopom sa kvasinky javia ako jednotlivé oválne alebo guľovité častice, z ktorých niektoré môžu pučať do dcérskych buniek. Obrázok nižšie ukazuje 293 buniek kontaminovaných kvasinkami.

Vírusová kontaminácia:

Vírusy majú extrémne malé veľkosti, čo sťažuje ich detekciu a odstránenie z činidiel používaných v bunkovej kultúre. Pretože väčšina vírusov má veľmi prísne požiadavky na svojich hostiteľov, vo všeobecnosti nemajú nepriaznivé účinky na bunkové kultúry z iných hostiteľských druhov, než sú ich vlastné. Použitie bunkových kultúr infikovaných vírusmi však môže pre experimentálnych operátorov predstavovať vážne zdravotné hrozby.

Mykoplazmová kontaminácia:

Mykoplazma sa považuje za najmenší samoreprodukujúci sa organizmus. Vzhľadom na jej extrémne malú veľkosť je detekcia mykoplazmy veľmi ťažká a často neexistujú žiadne zjavné príznaky infekcie, pokiaľ nie je hustota veľmi vysoká. Niektoré mykoplazmy môžu dokonca pretrvávať v bunkových kultúrach bez toho, aby spôsobili bunkovú smrť, ale môžu zmeniť správanie a metabolizmus buniek v kultivačnom systéme. Možné prejavy chronickej mykoplazmovej infekcie zahŕňajú zníženie rýchlosti bunkovej proliferácie, zníženie jadrovej hustoty a agregáciu buniek v suspenznej kultúre. Najúčinnejšími metódami na detekciu kontaminácie mykoplazmami sú fluorescenčné farbenie, ELISA, PCR, imunofarbenie, rádiografické samovyvíjanie alebo techniky mikrobiologického stanovenia na periodické testovanie kultúry.

Krížová kontaminácia:

Hoci to nie je také bežné ako mikrobiálna kontaminácia, rozšírená krížová kontaminácia medzi mnohými bunkovými líniami a rýchlo rastúcimi bunkovými líniami, ako sú bunky HeLa, je jasným problémom. Získavanie bunkových línií z renomovaných bunkových bánk, pravidelná kontrola vlastností bunkových línií a používanie dobrých aseptických techník sú konvenčné metódy, ktoré pomáhajú predchádzať krížovej kontaminácii.

Užívanie antibiotík:

Antibiotiká by sa v bunkovej kultúre nemali bežne používať, pretože ich nadmerné používanie môže podporovať vývoj kmeňov odolných voči antibiotikám, čo vedie k pretrvávajúcej nízkej úrovni kontaminácie. Po odstránení antibiotík sa táto nízka úroveň kontaminácie môže časom rozvinúť do rozsiahlej kontaminácie a ďalšie používanie antibiotík môže tiež maskovať mykoplazmové infekcie a iné typy kontaminácie. Preto sa antibiotiká môžu používať len ako posledná možnosť proti kontaminácii a mali by sa používať len krátkodobo a mali by sa čo najskôr odstrániť.