Jak zabránit kontaminaci v buněčné kultuře?

Tento článek zavádí hlavně běžné typy kontaminace buněk.

Pracovní oblast:

1. Je ventilační kapuce pro buněčnou kulturu nastaveno správně?

2. Existují nějaké proudy vzduchu nebo přímé vstupní kanály v oblasti, kde je umístěna kapuce ventilace buněčné kultury?

3. Je Workbench čistý?

4. Máte pouze položky požadované pro experiment na pracovní stůl?

5. 
   

6. Otřeli jste si pracovní stůl se 70% ethanolem před zahájením práce?

7. Čistíte a dezinfikujete a dezinfikujete inkubátor, lednici, mrazák a další laboratorní zařízení?

Osobní hygiena:

1. Umyli jste si ruce?

2. Měli jste na sobě osobní ochranné prostředky?

3. Pokud máte dlouhé vlasy, je to svázané zpět?

4. Používáte pipetu k manipulaci s tekutinami?

5. Činidla a kultivační média

6. Sterilizovali jste všechna činidla, média a řešení připravená v laboratoři pomocí vhodných metod?

7. Před umístěním kontejnerů, kulturních lahví, kulturních desek a kulturních jídel jste si otřeli jejich exteriéry 70% ethanolem?

8. Zpřísnili jste víčka lahví s činidla, kulturních lahví a dalších nádob, když se nepoužili?

9. Byly všechny kultivační desky umístěny do sterilních, vzduchotěsných tašek?

10. Existují nějaké známky kontaminace v činidlech, jako je oblačnost, plovoucí částice, nepříjemné pachy nebo neobvyklé barvy? Pokud ano, vyčistili jste je nebo zahodili?

Operace:

1. Pracujete pomalu, pečlivě a věnujete pozornost aseptickým technikám?

2. Otřeli jste si povrchy pipet, lahví s činidlem a kulturních lahví se 70% ethanolem, než jste je umístili do ventilační kapuce buněčné kultury?

3. Umístili jste víčka směrem dolů do pracovní oblasti?

4. Používáte sterilní skleněné pipety nebo jednorázové sterilní plastové pipety k manipulaci s tekutinami?

5. Používáte sterilní pipety pouze jednou, abyste se vyhnuli křížové kontaminaci?

6. Vyhýbali jste se dotknout se špičky pipety na žádné nesterilní předměty, včetně vnějšího okraje nití krku láhve?

7. Pokud dojde k úniku kapaliny, okamžitě jste ji absorbovali a otřete oblast 70% ethanolem?

Je třeba poznamenat, že umístění a uspořádání předmětů na super čisté lavičce, jakož i osobní hygienu, jako jsou dlouhé vlasy, lze snadno přehlédnout. Příliš mnoho předmětů na super čisté lavici může způsobit rušení proudění vzduchu a tlaku vzduchu, takže každý musí věnovat pozornost.

'Znáte sebe a svého nepřítele a nikdy nebudete poraženi ve stovkách bitvy.' '„ Vědět, jak zabránit kontaminaci, musíme také vědět, jak to identifikovat. Koneckonců, kontaminované buňky musí být okamžitě vyřazeny, jinak, pokud kontaminanty shromažďují všechny drahokamy, bude to ...

Kontaminace buněčné kultury je rozdělena hlavně do dvou kategorií: chemické kontaminanty, jako jsou nečistoty v kultivačních médiích, séru a vodě, endotoxiny, změkčovačem a detergenty; a biologické kontaminanty, jako jsou bakterie, houby, kvasinky, viry, mykoplazma a křížová kontaminace jiných buněčných linií.

Bakteriální kontaminace:

Bakterie přicházejí v různých tvarech, jako je sférická, tyč ve tvaru a spirály. Bakterie a houby společně tvoří nejčastěji vycházející biologické kontaminanty v buněčné kultuře. Když jsou buňky kontaminovány bakteriemi, lze je často detekovat během jednoho nebo dvou dnů jednoduchým pozorováním pouhým okem a hodnota pH kultivačního média se může náhle snížit. Obrázek níže ukazuje 293 buněk kontaminovaných E. coli a rostou jako adherentní buňky.

Plísňová kontaminace:

V počátečním stádiu plísňové kontaminace zůstává pH kultivačního média stabilní, ale jak se kontaminace zhoršuje, pH se rychle zvyšuje, což způsobuje, že se médium stane zakaleným. Pod mikroskopem se hyfy často objevují jako tenké svazky a někdy jako husté shluky spór. Spory vydrží během klidu extrémně drsného a nepříznivého prostředí. Proto, když dojde k nečinnosti plísňové kontaminace, je nutné okamžitě zlikvidovat buňky, aby se zabránilo velké kontaminaci v inkubátoru.

Kontaminace kvasinek:

Podobně jako bakteriální kontaminace se kultivační médium zakalí, když je kontaminováno kvasinkami, zejména během kontaminace v pozdním stádiu. PH kultivačního média se po kontaminaci kvasinkami mění velmi málo a zvyšuje se pouze tehdy, když je kontaminace závažná. Pod mikroskopem se kvasinky objevují jako jednotlivé oválné nebo sférické částice, z nichž některé se mohou pustit do dceřiných buněk. Obrázek níže ukazuje 293 buněk kontaminovaných kvasinkami.

Kontaminace virů:

Viry mají extrémně malé velikosti, což ztěžuje jejich detekci a odstranění z činidel použitých v buněčné kultuře. Protože většina virů má pro své hostitele velmi přísné požadavky, obecně nemají nepříznivé účinky na buněčné kultury od jiných hostitelských druhů než jejich vlastní. Použití buněčných kultur infikovaných viry však může představovat vážné zdravotní hrozby pro experimentální operátory.

Kontaminace Mycoplasma:

Mycoplasma je považován za nejmenší samoreplikující organismus. Vzhledem k jeho extrémně malé velikosti je detekce mykoplazmy velmi obtížná a často neexistují žádné zjevné známky infekce, pokud není hustota velmi vysoká. Některá mykoplasma může dokonce přetrvávat v buněčných kulturách, aniž by způsobila buněčnou smrt, ale mohou změnit chování a metabolismus buněk v kulturním systému. Možné projevy chronické infekce mykoplasmy zahrnují snížení rychlosti proliferace buněk, snížení jaderné hustoty a agregace buněk v kultuře suspenze. Nejúčinnějšími metodami pro detekci kontaminace mykoplasmy je fluorescenční barvení, ELISA, PCR, imunostainování, radiografické sebe-rozvoje nebo mikrobiologické determinační techniky pro pravidelné testování kultury.

Křížová kontaminace:

Ačkoli to není tak běžné jako mikrobiální kontaminace, je jasným problémem rozšířená křížová kontaminace mezi mnoha buněčnými liniemi a rychle rostoucími buněčnými liniemi, jako jsou HeLa buňky. Získání buněčných linií z renomovaných buněčných bank, pravidelné kontroly vlastností buněčných linií a použití dobrých aseptických technik jsou konvenční metody, které pomáhají zabránit křížové kontaminaci.

Použití antibiotik:

Antibiotika by neměla být rutinně používána v buněčné kultuře, protože jejich nadměrné použití může podpořit vývoj kmenů rezistentních na antibiotiky, což vede k přetrvávající kontaminaci nízké úrovně. Jakmile jsou antibiotika odstraněna, může se tato kontaminace nízké úrovně nakonec vyvinout do kontaminace ve velkém měřítku a pokračující používání antibiotik může také maskovat infekce mykoplazmy a další typy kontaminace. Proto mohou být antibiotika použita pouze jako poslední možnost proti kontaminaci a měla by být používána pouze po krátkou dobu a měla by být odstraněna co nejdříve.