Jak zabránit kontaminaci v buněčné kultuře?

Tento článek představuje především běžné typy buněčné kontaminace.

Pracovní oblast:

1. Je ventilační kryt pro buněčnou kulturu správně nastaven?

2. Jsou v oblasti, kde je umístěn ventilační kryt pro buněčnou kulturu, nějaké proudění vzduchu nebo přímé vstupní kanály?

3. Je pracovní stůl čistý?

4. Byly na pracovní stůl umístěny pouze položky potřebné pro experiment?

5. 
   

6. Vytřeli jste před zahájením práce pracovní stůl 70% etanolem?

7. Čistíte a dezinfikujete pravidelně inkubátor, lednici, mrazák a další laboratorní vybavení?

Osobní hygiena:

1. Umyl sis ruce?

2. Nosili jste osobní ochranné prostředky?

3. Pokud máte dlouhé vlasy, máte je svázané?

4. Používáte k manipulaci s kapalinami pipetu?

5. Reagencie a kultivační média

6. Sterilizovali jste všechna činidla, média a roztoky připravené v laboratoři pomocí vhodných metod?

7. Před umístěním nádob, kultivačních lahví, kultivačních misek a kultivačních misek na pracovní plochu jste otřeli jejich vnější povrchy 70% etanolem?

8. Utáhli jste víčka lahví s činidly, kultivačních lahví a dalších nádob, když je nepoužíváte?

9. Byly všechny kultivační misky umístěny ve sterilních, vzduchotěsných sáčcích?

10. Jsou v reagenciích nějaké známky kontaminace, jako je zákal, plovoucí částice, nepříjemný zápach nebo abnormální barvy? Pokud ano, vyčistili jste je nebo vyřadili?

Operace:

1. Pracujete pomalu, pečlivě a dbáte na aseptické techniky?

2. Otřeli jste povrchy pipet, lahví s reagenciemi a kultivačních lahví 70% etanolem před jejich umístěním do ventilačního krytu pro buněčnou kulturu?

3. Umístili jste víka v pracovní oblasti směrem dolů?

4. Používáte pro manipulaci s kapalinami sterilní skleněné pipety nebo jednorázové sterilní plastové pipety?

5. Používáte sterilní pipety pouze jednou, abyste se vyhnuli křížové kontaminaci?

6. Nedotýkali jste se špičkou pipety jakýchkoli nesterilních předmětů, včetně vnějšího okraje závitů hrdla láhve?

7. Pokud dojde k rozlití kapaliny, okamžitě jste ji absorbovali a otřeli místo 70% etanolem?

Je třeba poznamenat, že umístění a uspořádání předmětů na super čisté lavici, stejně jako osobní hygiena, jako jsou dlouhé vlasy, lze snadno přehlédnout. Příliš mnoho předmětů na super čisté lavici může rušit proudění vzduchu a tlak vzduchu, takže každý musí věnovat pozornost.

'Poznej sebe a svého nepřítele a nikdy nebudeš poražen ve stovce bitev.' Když víme, jak zabránit kontaminaci, musíme také vědět, jak ji identifikovat. Koneckonců, kontaminované buňky je třeba okamžitě zlikvidovat, jinak, pokud kontaminanty posbírají všechny drahokamy, bude...

Kontaminace buněčných kultur se dělí hlavně do dvou kategorií: chemické kontaminanty, jako jsou nečistoty v kultivačních médiích, séru a vodě, endotoxiny, změkčovadla a detergenty; a biologické kontaminanty, jako jsou bakterie, houby, kvasinky, viry, mykoplazmata a křížová kontaminace jiných buněčných linií.

Bakteriální kontaminace:

Bakterie mají různé tvary, například kulovité, tyčovité a spirálovité. Bakterie a houby společně tvoří nejčastěji se vyskytující biologické kontaminanty v buněčné kultuře. Když jsou buňky kontaminovány bakteriemi, lze to často detekovat během jednoho nebo dvou dnů pouhým pozorováním pouhým okem a hodnota pH kultivačního média se může náhle snížit. Obrázek níže ukazuje 293 buněk kontaminovaných E. coli a rostoucích jako adherentní buňky.

Plísňová kontaminace:

V počáteční fázi plísňové kontaminace zůstává pH kultivačního média stabilní, ale jak se kontaminace zhoršuje, pH se rychle zvyšuje, což způsobuje zakalení média. Pod mikroskopem se hyfy často jeví jako tenké svazky a někdy jako husté shluky výtrusů. Spory snesou extrémně drsné a nepříznivé prostředí během dormance. Proto, když dojde k plísňové kontaminaci, je nutné buňky urychleně zlikvidovat, aby se zabránilo rozsáhlé kontaminaci v inkubátoru.

Kvasinková kontaminace:

Podobně jako u bakteriální kontaminace se kultivační médium zakalí, když je kontaminováno kvasinkami, zejména v pozdní fázi kontaminace. pH kultivačního média se po kontaminaci kvasinkami mění jen velmi málo a zvyšuje se pouze tehdy, když je kontaminace silná. Pod mikroskopem se kvasinky jeví jako jednotlivé oválné nebo kulovité částice, z nichž některé mohou vyrazit do dceřiných buněk. Obrázek níže ukazuje 293 buněk kontaminovaných kvasinkami.

Virová kontaminace:

Viry mají extrémně malé velikosti, takže je obtížné je detekovat a odstranit z činidel používaných v buněčné kultuře. Protože většina virů má velmi přísné požadavky na své hostitele, obecně nemají nepříznivé účinky na buněčné kultury jiných hostitelských druhů, než jsou jejich vlastní. Použití buněčných kultur infikovaných viry však může pro experimentální operátory představovat vážné ohrožení zdraví.

Mykoplazmová kontaminace:

Mycoplasma je považována za nejmenší samoreprodukující se organismus. Vzhledem k extrémně malé velikosti je detekce mykoplazmat velmi obtížná a často nejsou patrné žádné známky infekce, pokud není hustota velmi vysoká. Některá mykoplazmata mohou dokonce přetrvávat v buněčných kulturách, aniž by způsobila buněčnou smrt, ale mohou změnit chování a metabolismus buněk v kultivačním systému. Mezi možné projevy chronické mykoplazmatické infekce patří snížení rychlosti buněčné proliferace, snížení jaderné hustoty a agregace buněk v suspenzní kultuře. Nejúčinnějšími metodami detekce kontaminace mykoplazmaty jsou fluorescenční barvení, ELISA, PCR, imunobarvení, rentgenové samovyvíjení nebo techniky mikrobiologického stanovení pro periodické testování kultury.

Křížová kontaminace:

I když to není tak běžné jako mikrobiální kontaminace, rozšířená křížová kontaminace mezi mnoha buněčnými liniemi a rychle rostoucími buněčnými liniemi, jako jsou buňky HeLa, je jasným problémem. Získávání buněčných linií z renomovaných buněčných bank, pravidelná kontrola vlastností buněčných linií a používání dobrých aseptických technik jsou konvenčními metodami, které pomáhají vyhnout se křížové kontaminaci.

Užívání antibiotik:

Antibiotika by neměla být běžně používána v buněčné kultuře, protože jejich nadměrné používání může podporovat vývoj kmenů rezistentních na antibiotika, což vede k přetrvávající nízké úrovni kontaminace. Jakmile jsou antibiotika odstraněna, může se tato nízkoúrovňová kontaminace nakonec rozvinout v kontaminaci velkého rozsahu a pokračující používání antibiotik může také maskovat mykoplazmatické infekce a další typy kontaminace. Proto lze antibiotika použít pouze jako poslední možnost proti kontaminaci a měla by být používána pouze krátkodobě a měla by být odstraněna co nejdříve.