Come prevenire la contaminazione nella coltura cellulare?

Questo articolo introduce principalmente tipi comuni di contaminazione cellulare.

Area di lavoro:

1. La cappa di ventilazione per la coltura cellulare è posizionata correttamente?

2. Sono presenti flussi d'aria o canali di ingresso diretto nell'area in cui si trova la cappa di ventilazione per colture cellulari?

3. Il banco di lavoro è pulito?

4. Sul banco di lavoro sono stati posizionati solo gli oggetti necessari per l'esperimento?

5. 
   

6. Hai pulito il banco di lavoro con etanolo al 70% prima di iniziare a lavorare?

7. Pulisci e disinfetta regolarmente l'incubatore, il frigorifero, il congelatore e altre apparecchiature di laboratorio?

Igiene personale:

1. Ti sei lavato le mani?

2. Hai indossato dispositivi di protezione individuale?

3. Se hai i capelli lunghi, li raccogli dietro?

4. Stai utilizzando una pipetta per gestire i liquidi?

5. Reagenti e terreni di coltura

6. Sono stati sterilizzati tutti i reagenti, i terreni e le soluzioni preparati in laboratorio utilizzando metodi appropriati?

7. Prima di posizionare contenitori, bottiglie di coltura, piastre di coltura e piastre di coltura sulla superficie di lavoro, hai pulito le loro superfici esterne con etanolo al 70%?

8. Hai stretto i coperchi dei flaconi dei reagenti, dei flaconi delle colture e di altri contenitori quando non sono in uso?

9. Tutte le piastre di coltura sono state collocate in sacchetti sterili e ermetici?

10. Sono presenti segni di contaminazione nei reagenti, come torbidità, particelle fluttuanti, odori sgradevoli o colori anomali? Se sì, li hai puliti o scartati?

Operazione:

1. Stai operando lentamente, con attenzione e prestando attenzione alle tecniche asettiche?

2. Le superfici delle pipette, dei flaconi dei reagenti e dei flaconi delle colture sono state pulite con etanolo al 70% prima di posizionarli nella cappa di ventilazione delle colture cellulari?

3. Hai posizionato i coperchi rivolti verso il basso nell'area di lavoro?

4. Utilizzi pipette di vetro sterili o pipette di plastica sterili monouso per gestire i liquidi?

5. Si utilizzano pipette sterili solo una volta per evitare la contaminazione incrociata?

6. Hai evitato di toccare la punta della pipetta con oggetti non sterili, compreso il bordo esterno delle filettature del collo della bottiglia?

7. Se si verificano fuoriuscite di liquido, lo hai assorbito immediatamente e hai pulito l'area con etanolo al 70%?

Va notato che il posizionamento e la disposizione degli oggetti sulla panca super pulita, così come l’igiene personale come i capelli lunghi, vengono facilmente trascurati. Troppi oggetti sulla panca super pulita possono causare interferenze con il flusso d'aria e la pressione dell'aria, quindi tutti devono prestare attenzione.

'Conosci te stesso e il tuo nemico, e non sarai mai sconfitto in cento battaglie.' Per prevenire la contaminazione bisogna anche saperla identificare. Dopotutto, le cellule contaminate devono essere smaltite tempestivamente, altrimenti, se i contaminanti raccolgono tutte le gemme, sarà...

La contaminazione delle colture cellulari è principalmente divisa in due categorie: contaminanti chimici, come impurità nei terreni di coltura, siero e acqua, endotossine, plastificanti e detergenti; e contaminanti biologici, come batteri, funghi, lieviti, virus, micoplasma e contaminazione incrociata di altre linee cellulari.

Contaminazione batterica:

I batteri sono disponibili in varie forme, come sferici, a forma di bastoncino e a forma di spirale. Batteri e funghi insieme costituiscono i contaminanti biologici più comunemente riscontrati nelle colture cellulari. Quando le cellule sono contaminate da batteri, spesso questi possono essere rilevati entro uno o due giorni mediante la semplice osservazione ad occhio nudo e il valore del pH del terreno di coltura può diminuire improvvisamente. L'immagine seguente mostra 293 cellule contaminate da E. coli che crescono come cellule aderenti.

Contaminazione fungina:

Nella fase iniziale della contaminazione fungina, il pH del terreno di coltura rimane stabile, ma man mano che la contaminazione peggiora, il pH aumenta rapidamente, rendendo il terreno torbido. Al microscopio, le ife appaiono spesso come fasci sottili e talvolta come densi ammassi di spore. Le spore possono resistere ad ambienti estremamente difficili e sfavorevoli durante la dormienza. Pertanto, quando si verifica una contaminazione fungina, è necessario eliminare tempestivamente le cellule per evitare una contaminazione su larga scala nell'incubatrice.

Contaminazione del lievito:

Similmente alla contaminazione batterica, il terreno di coltura diventa torbido quando contaminato da lievito, soprattutto durante la contaminazione in fase avanzata. Il pH del terreno di coltura cambia molto poco dopo la contaminazione con il lievito e aumenta solo quando la contaminazione è grave. Al microscopio, il lievito appare come singole particelle ovali o sferiche, alcune delle quali possono germogliare nelle cellule figlie. L'immagine sotto mostra 293 cellule contaminate con lievito.

Contaminazione virale:

I virus hanno dimensioni estremamente piccole, il che rende difficile rilevarli e rimuoverli dai reagenti utilizzati nella coltura cellulare. Poiché la maggior parte dei virus ha requisiti molto severi per i propri ospiti, generalmente non hanno effetti negativi sulle colture cellulari di specie ospiti diverse dalla propria. Tuttavia, l’uso di colture cellulari infette da virus può rappresentare una grave minaccia per la salute degli operatori sperimentali.

Contaminazione da micoplasma:

Il micoplasma è considerato il più piccolo organismo autoreplicante. A causa delle sue dimensioni estremamente ridotte, il rilevamento del micoplasma è molto difficile e spesso non vi sono segni evidenti di infezione a meno che la densità non sia molto elevata. Alcuni micoplasmi possono anche persistere nelle colture cellulari senza causare la morte cellulare, ma possono alterare il comportamento e il metabolismo delle cellule nel sistema di coltura. Le possibili manifestazioni dell'infezione cronica da micoplasma comprendono una diminuzione del tasso di proliferazione cellulare, una diminuzione della densità nucleare e dell'aggregazione cellulare nella coltura in sospensione. I metodi più efficaci per rilevare la contaminazione da micoplasma sono la colorazione a fluorescenza, ELISA, PCR, immunocolorazione, autosviluppo radiografico o tecniche di determinazione microbiologica per testare periodicamente la coltura.

Contaminazione incrociata:

Sebbene non sia comune come la contaminazione microbica, la diffusa contaminazione incrociata tra molte linee cellulari e linee cellulari in rapida crescita come le cellule HeLa è un problema chiaro. Ottenere linee cellulari da banche cellulari affidabili, controllare regolarmente le proprietà delle linee cellulari e utilizzare buone tecniche asettiche sono metodi convenzionali per evitare la contaminazione incrociata.

Uso di antibiotici:

Gli antibiotici non dovrebbero essere utilizzati di routine nelle colture cellulari perché il loro uso eccessivo può favorire lo sviluppo di ceppi resistenti agli antibiotici, portando a una contaminazione persistente di basso livello. Una volta rimossi gli antibiotici, questa contaminazione di basso livello può eventualmente svilupparsi in una contaminazione su larga scala e l’uso continuato di antibiotici può anche mascherare infezioni da micoplasma e altri tipi di contaminazione. Pertanto, gli antibiotici possono essere utilizzati solo come ultima risorsa contro la contaminazione e dovrebbero essere utilizzati solo per un breve periodo di tempo e dovrebbero essere rimossi il prima possibile.